dc.contributor.author
Ludwig, Leif Si-Hun
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:42:37Z
dc.date.available
2017-05-29T09:17:22.279Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/9564
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13763
dc.description.abstract
Introduction Genome-wide association and exome sequencing studies have
identified numerous genetic variants associated with human traits and disease.
In many instances, a detailed understanding of the underlying molecular
mechanisms of these associations is lacking. In this study, we functionally
followed up on common and rare genetic variants associated with human red
blood cell traits, anemia and erythrocytosis. First, we followed up on genetic
population studies associating common variants near the cyclin A2 (CCNA2)
locus to red blood cell traits and investigated the thus far undefined role of
CCNA2 in erythropoiesis. Next, we identified a rare coding mutant (Y365C) in
the X-chromosomal ALAS2 gene, encoding for 5’-aminolevulinate synthase 2, in a
single affected family presenting with macrocytic anemia and dyserythropoiesis
and studied the functional effects of the mutant. Finally, we utilized insight
from studies on common and rare genetic variation to determine that coding
variants in SH2B3, a negative regulator of cytokine signaling, are associated
with erythrocyte counts and explored the potential of this finding to improve
the process of in vitro red blood cell production. Methods In vitro culture
models were utilized to study associated genes in primary erythroid cells
derived from murine fetal liver or healthy human donors. Patient derived
cells, shRNA-mediated knockdown and genome editing approaches were utilized to
study the consequences of disrupting each gene of interest. Cultured cells
were characterized using a variety of methods, including flow cytometry
assays, microscopic imaging, western blotting, quantitative PCR and
bioinformatic analysis. Results Careful analysis of a murine Ccna2 knockdown
revealed an important role for this cell cycle gene in cytokinesis during
terminal erythropoiesis, which led to the production of red blood cells with
increased size. Characterization of the Y365C mutation showed disrupted
pyridoxine cofactor binding, destabilization and resulting loss of function of
the ALAS2 enzyme. Finally, genetic disruption of SH2B3 expression in stem and
progenitor cells increased erythroid proliferation, maturation and ultimately
production by 3-7 fold. Conclusions By following up on genetic variants
associated with erythroid phenotypes, we have revealed an unrecognized role of
cyclin A2 in cytokinesis and characterize a new loss of function mutation in
ALAS2. Furthermore, targeted disruption of SH2B3 may provide a useful avenue
to enhance red blood cell production for cell replacement therapies. Together
these findings illustrate how functional studies of genetic variants can
result in important applications and provide a deeper understanding of human
variation in physiology and disease.
de
dc.description.abstract
Einleitung Genomweite Assoziationsstudien und die vermehrte Anwendung von
Exom- Sequenzierung haben zur Entdeckung einer Vielzahl von neuen und mit
humanen Merkmalen und Krankheiten assoziierten genetischen Varianten geführt.
In vielen Fällen fehlt jedoch ein über die Assoziation hinausgehendes
detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Im
Rahmen dieser Arbeit haben wir eine Reihe von mit Erythrozyten-Parametern und
mit Anämie sowie Erythrozytose assoziierte genetische Varianten funktionell
untersucht. Zunächst haben wir auf Grundlage von Populationsstudien, welche
häufige Polymorphismen im cyclin A2 (CCNA2) Lokus mit der Größe von roten
Blutkörperchen assoziiert haben, die bisher undefinierte Rolle von CCNA2 in
der Erythropoese untersucht. Weiterhin haben wir eine seltene Mutation (Y365C)
im X-chromosomalen für die 5-Aminolävulinatsynthase kodierenden ALAS2 in einer
Familie mit makrozytärer Anämie und Dyserythropoese entdeckt und die
funktionellen Effekte der Mutante charakterisiert. Schließlich haben wir
aufgrund von mit der Erythrozytenzahl assoziierten häufigen und seltenen
genetischen Varianten im Gen SH2B3, einem negativen Regulator der Zytokin
Signaltransduktion, die Möglichkeit der Inaktivierung von SH2B3 zur
Optimierung der in vitro Produktion von roten Blutkörperchen exploriert.
Methodik Für die Untersuchung der assoziierten Gene wurden in vitro
Kulturmodelle primärer erythropoetischer Zellen aus der murinen fetalen Leber
und von humanen Spendern eingesetzt. Um den Funktionsverlust und dessen
Konsequenzen der relevanten Gene zu ermitteln wurden shRNA-vermittelter
Knockdown bzw. Genome Editing angewendet und von Patienten isolierte Zellen
genutzt. Die Charakterisierung der kultivierten Zellen erfolgte durch eine
Reihe an Methoden, einschließlich durchflusszytometrischer Verfahren,
Lichtmikroskopie, Westernblot, quantitativer PCR und bioinformatischer
Analysen. Ergebnisse Die Charakterisierung des Knockdowns von murinem Ccna2
offenbarte eine wichtige Funktion dieses Zellzyklus-Regulators in der
Zytokinese im Rahmen der terminalen Erythropoese und führte zur Produktion von
größeren roten Blutkörperchen. Die Untersuchung der Y365C Mutante zeigte eine
gestörte Bindung des Kofaktors Pyridoxins, sowie Destabilisierung und
Funktionsverlust des ALAS2-Enzyms. Die Inaktivierung der SH2B3 Expression in
humanen Stamm- und Vorläuferzellen begünstigte die Proliferation sowie
Differenzierung von erythropoetischen Zellen und erhöhte letztlich die
Produktion von roten Blutkörperchen um das drei- bis siebenfache.
Schlussfolgerung Mittels funktioneller Studien von genetischen Varianten haben
wir eine bisher unbekannte Rolle von cyclin A2 im Rahmen der Zytokinese
offenbart und charakterisieren eine neue Funktionsverlustmutante in ALAS2.
Weiterhin stellt die Inaktivierung von SH2B3 eine praktische Möglichkeit zur
Steigerung der Produktion von roten Blutkörperchen für Zellersatzverfahren und
ähnliche Therapien dar. Zusammen zeigen diese Studien, wie die funktionelle
Untersuchung genetischer Varianten und menschlicher Variation zur Entwicklung
von neuen Anwendungen und zu einem tieferen Verständnis von Physiologie und
Krankheit beitragen kann.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
erythropoiesis
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Functional studies of genetic variants in human erythropoiesis
dc.contributor.firstReferee
N.N.
dc.contributor.furtherReferee
N.N.
dc.date.accepted
2017-06-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104339-7
dc.title.translated
Funktionelle Studien genetischer Varianten in der humanen Erythropoese
de
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
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FUDISS_thesis_000000104339
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FUDISS_derivate_000000021163
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open access