Introduction Genome-wide association and exome sequencing studies have identified numerous genetic variants associated with human traits and disease. In many instances, a detailed understanding of the underlying molecular mechanisms of these associations is lacking. In this study, we functionally followed up on common and rare genetic variants associated with human red blood cell traits, anemia and erythrocytosis. First, we followed up on genetic population studies associating common variants near the cyclin A2 (CCNA2) locus to red blood cell traits and investigated the thus far undefined role of CCNA2 in erythropoiesis. Next, we identified a rare coding mutant (Y365C) in the X-chromosomal ALAS2 gene, encoding for 5’-aminolevulinate synthase 2, in a single affected family presenting with macrocytic anemia and dyserythropoiesis and studied the functional effects of the mutant. Finally, we utilized insight from studies on common and rare genetic variation to determine that coding variants in SH2B3, a negative regulator of cytokine signaling, are associated with erythrocyte counts and explored the potential of this finding to improve the process of in vitro red blood cell production. Methods In vitro culture models were utilized to study associated genes in primary erythroid cells derived from murine fetal liver or healthy human donors. Patient derived cells, shRNA-mediated knockdown and genome editing approaches were utilized to study the consequences of disrupting each gene of interest. Cultured cells were characterized using a variety of methods, including flow cytometry assays, microscopic imaging, western blotting, quantitative PCR and bioinformatic analysis. Results Careful analysis of a murine Ccna2 knockdown revealed an important role for this cell cycle gene in cytokinesis during terminal erythropoiesis, which led to the production of red blood cells with increased size. Characterization of the Y365C mutation showed disrupted pyridoxine cofactor binding, destabilization and resulting loss of function of the ALAS2 enzyme. Finally, genetic disruption of SH2B3 expression in stem and progenitor cells increased erythroid proliferation, maturation and ultimately production by 3-7 fold. Conclusions By following up on genetic variants associated with erythroid phenotypes, we have revealed an unrecognized role of cyclin A2 in cytokinesis and characterize a new loss of function mutation in ALAS2. Furthermore, targeted disruption of SH2B3 may provide a useful avenue to enhance red blood cell production for cell replacement therapies. Together these findings illustrate how functional studies of genetic variants can result in important applications and provide a deeper understanding of human variation in physiology and disease.
Einleitung Genomweite Assoziationsstudien und die vermehrte Anwendung von Exom- Sequenzierung haben zur Entdeckung einer Vielzahl von neuen und mit humanen Merkmalen und Krankheiten assoziierten genetischen Varianten geführt. In vielen Fällen fehlt jedoch ein über die Assoziation hinausgehendes detailliertes Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir eine Reihe von mit Erythrozyten-Parametern und mit Anämie sowie Erythrozytose assoziierte genetische Varianten funktionell untersucht. Zunächst haben wir auf Grundlage von Populationsstudien, welche häufige Polymorphismen im cyclin A2 (CCNA2) Lokus mit der Größe von roten Blutkörperchen assoziiert haben, die bisher undefinierte Rolle von CCNA2 in der Erythropoese untersucht. Weiterhin haben wir eine seltene Mutation (Y365C) im X-chromosomalen für die 5-Aminolävulinatsynthase kodierenden ALAS2 in einer Familie mit makrozytärer Anämie und Dyserythropoese entdeckt und die funktionellen Effekte der Mutante charakterisiert. Schließlich haben wir aufgrund von mit der Erythrozytenzahl assoziierten häufigen und seltenen genetischen Varianten im Gen SH2B3, einem negativen Regulator der Zytokin Signaltransduktion, die Möglichkeit der Inaktivierung von SH2B3 zur Optimierung der in vitro Produktion von roten Blutkörperchen exploriert. Methodik Für die Untersuchung der assoziierten Gene wurden in vitro Kulturmodelle primärer erythropoetischer Zellen aus der murinen fetalen Leber und von humanen Spendern eingesetzt. Um den Funktionsverlust und dessen Konsequenzen der relevanten Gene zu ermitteln wurden shRNA-vermittelter Knockdown bzw. Genome Editing angewendet und von Patienten isolierte Zellen genutzt. Die Charakterisierung der kultivierten Zellen erfolgte durch eine Reihe an Methoden, einschließlich durchflusszytometrischer Verfahren, Lichtmikroskopie, Westernblot, quantitativer PCR und bioinformatischer Analysen. Ergebnisse Die Charakterisierung des Knockdowns von murinem Ccna2 offenbarte eine wichtige Funktion dieses Zellzyklus-Regulators in der Zytokinese im Rahmen der terminalen Erythropoese und führte zur Produktion von größeren roten Blutkörperchen. Die Untersuchung der Y365C Mutante zeigte eine gestörte Bindung des Kofaktors Pyridoxins, sowie Destabilisierung und Funktionsverlust des ALAS2-Enzyms. Die Inaktivierung der SH2B3 Expression in humanen Stamm- und Vorläuferzellen begünstigte die Proliferation sowie Differenzierung von erythropoetischen Zellen und erhöhte letztlich die Produktion von roten Blutkörperchen um das drei- bis siebenfache. Schlussfolgerung Mittels funktioneller Studien von genetischen Varianten haben wir eine bisher unbekannte Rolle von cyclin A2 im Rahmen der Zytokinese offenbart und charakterisieren eine neue Funktionsverlustmutante in ALAS2. Weiterhin stellt die Inaktivierung von SH2B3 eine praktische Möglichkeit zur Steigerung der Produktion von roten Blutkörperchen für Zellersatzverfahren und ähnliche Therapien dar. Zusammen zeigen diese Studien, wie die funktionelle Untersuchung genetischer Varianten und menschlicher Variation zur Entwicklung von neuen Anwendungen und zu einem tieferen Verständnis von Physiologie und Krankheit beitragen kann.
