Structure-Function Analysis of the Z-DNA binding domain Zalpha of the RNA editing enzyme ADAR1

Abstract

The discovery of the first naturally occurring Z-DNA binding protein domain, Za, at the N-terminus of the mammalian RNA editing enzyme ADAR1 raised questions concerning the structural and functional characteristics that allow Za to specifically interact with Z-DNA. In this Ph.D. thesis, the solution structure of human Za was determined with high coordinate precision by multi- dimensional NMR spectroscopy. The structure was set in a functional context by scanning mutagenesis, interaction mapping and biochemical binding studies. By using site-directed mutagenesis, a number of residues were identified that diminished binding to Z-DNA when mutated to alanine. In conjunction with the complementary data from interaction mapping, these results allowed one to determine the interaction surface between Za and Z-DNA in solution. Residues from helix a3 and the C-terminal b-sheet form a contiguous, positively charged surface on Za that is suitably shaped to bind to the negatively charged backbone of Z-DNA. Binding studies by analytical ultracentrifugation and surface plasmon resonance spectroscopy showed that two Za domains bind to one d(CG)3T4(CG)3 hairpin in the Z-DNA conformation with a Kd of 30 nM. Comparison with the crystal structure of Za complexed with Z-DNA showed that seven of a total of nine Z-DNA contacting residues are prepositioned in the solution structure of unbound Za, though they are exposed on the protein surface. The prepositioned residues showed a large decrease in the free energy of binding (DDG) when mutated to alanine, while the flexible Z-DNA contacting residues showed no effect. This suggests that Za uses prepositioned residues to minimize the entropic cost of binding. Searching the structural database for similar proteins with the program DALI revealed a number of structurally homologous (a+b)HTH DNA binding proteins, such as histone H5, CAP, DtxR, E2F-4 and others. Comparison of the solution structure of Za with the crystal structure of these homologues complexed with cognate B-DNA suggests that Za is disfavored from binding to B-DNA by steric hindrance at two sites. Firstly, Za causes steric hindrance with the minor groove of B-DNA because it contains an extended helix a1 that is further elongated by a prehelix. Secondly, the aromatic ring of Y177 of Za collides with the major groove of B-DNA in the superposition with some homologous protein/B-DNA complexes. Consequently, Za may bind to Z-DNA rather than B-DNA firstly because it possesses a suitably shaped binding surface for Z-DNA, and secondly because binding to B-DNA is disfavored by steric hindrance.

Mit der Entdeckung der ersten, natürlich vorkommenden Z-DNA-bindenden Proteindomäne, Za, am N-Terminus des RNA editing Enzyms ADAR1 erhob sich die Frage nach den strukturellen und funktionalen Charakteristika, die für eine spezifische Interaktion zwischen Za und Z-DNA verantwortlich sind. In dieser Doktorarbeit wurde die hochaufgelöste Struktur der Za-Domäne aus humanem ADAR1 mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie in Lösung bestimmt. Die Proteinstruktur wurde mit Hilfe von systematischer, ortsspezifischer Mutagenese, Interaktionskartierung und biochemischen Bindungsexperimenten in einen funktionalen Zusammenhang gestellt. In der systematischen Mutagenesestudie wurden eine Reihe von Aminosäureresten identifiziert, die die Bindungsaffinität an Z-DNA reduzieren, wenn sie zu Alanin mutiert werden. Diese Daten erlauben in Verbindung mit der komplementären Information aus der Interaktionskartierung die Wechselwirkungsfläche zwischen Za und Z-DNA in wässriger Lösung zu bestimmen. Aminosäurereste aus a-Helix 3 und dem C-terminalen b-Faltblatt von Za bilden eine zusammenhängende, positiv geladene Oberfläche, die so geformt ist, daß sie mit dem negativ geladenen Rückgrat von Z-DNA interagieren kann. Die biochemischen Bindungsstudien zeigten, daß zwei Za-Domänen an einem d(CG)3T4(CG)3-Hairpin-Molekül in der Z-DNA Konformation mit einer Dissoziationskonstante von 30 nM binden. Der Vergleich der NMR- Struktur von ungebundenem Za mit der Kristallstruktur des (Za)2/Z-DNA Komplexes zeigte, daß 7 der insgesamt 9 Z-DNA kontaktierenden Aminosäureresten in der freien Proteinstruktur bereits so positioniert sind wie in der gebundenen Form, obgleich diese Reste an der Proteinoberfläche liegen. Diese "vor-positionierten" Aminosäurereste setzten die freie Bindungsenergie (DG) stark herab, als sie zu Alanin mutiert wurden, während die 2 flexiblen, Z-DNA kontaktierenden Aminosäurereste die freie Bindungsenergie nicht veränderten. Dies läßt darauf schließen, daß Za vor-positionierte Aminosäurereste verwendet, um den Entropiebetrag, der für die Bindung an Z-DNA aufzubringen ist, zu minimieren. Durch eine Ähnlichkeitssuche in der Proteinstrukturdatenbank (PDB) mit dem Programm DALI wurden mehr als ein Duzend strukturhomologe (a+b) helix-turn-helix B-DNA bindende Proteine, wie z.B. Histon H5, CAP, DtxR, E2F-4 u.a., gefunden. Der Vergleich der NMR- Struktur von Za mit den Kristallstrukturen dieser homologen Domänen gebunden an ihre Ziel-DNA deutet darauf hin, daß die Bindung von Za an B-DNA durch sterische Hinderung an 2 Positionen benachteiligt wird. In der Übereinanderlagerung von Za mit einem Teil der homologen Komplexstrukturen zeigte sich in der kleinen Grube der B-DNA eine sterische Hinderung durch die längere a-Helix 1 von Za, die durch eine vorausgehende a-Helix zusätzlich verlängert. Bei dem anderen Teil der homologen Komplexstrukturen ergab sich eine sterische Hinderung zwischen der großen Grube der B-DNA und dem aromatischen Ring von Za-Rest Y177. Zusammenfassend läßt sich schließen, daß Za bevorzugt an Z-DNA bindet, weil Za eine derart geformte Bindungsoberfläche besitzt, die energetisch vorteilhafte Interaktionen mit Z-DNA, nicht aber vergleichbare Interaktionen mit B-DNA, erlaubt.