Structural rearrangements upon opening of Channelrhodopsin-2

Abstract

Channelrhodopsins (ChRs) are ion channels that regulate phototaxis of green algae. The functional unit comprises a retinal chromophore embedded in seven transmembrane helices (7TM). Up to now, ChRs are the only light gated ion channels found in nature. After the discovery in 2002 the ChRs were soon exploited as a tool to trigger nerve cell action potentials. A new field of research, named optogenetics, was established. Since ChRs undergo a cyclic reaction triggered by light they can be investigated by a large set of different biophysical techniques and hence are ideal candidates to study the structure/function relationship on molecular level. In this work three functional ChR2 cysteine-variants were engineered to enable the site specific labeling of the cytosolic end of helix B and additionally helix F or C. The labeling positions can be investigated in the ground state as well as in the accumulated open state, P3. The variants were spin-labeled and subjected to pulsed electron double resonance (PELDOR) measurements. Thereby, an outward displacement of the cytosolic side of helix B and F in the open state could be observed. The helix B displacement persist also in the desensitized state, P4. These results strengthen the hypothesis of a prolongation of the pore between helices A, B, C and G by the observed outward movement of helix B in the open state. However, as suggested earlier, the major structural changes are to some extent decoupled from the on-gating, since the outward displacement of helix B persists in the desensitized state. Furthermore, we set the stage for the quantitative determination of the helix F movement, which is currently underway. The results of this thesis will help to guide the developments and benchmark future open state models.

Kanalrhodopsine (KR) sind Ionenkanäle, die die Phototaxis von Grünalgen steuern. Die funktionale Einheit umfasst ein Retinal-Chromophor, das in sieben Transmembranhelices eingebettet ist. Kanalrhodopsine sind die einzigen, natürlichen, lichtgesteuerten Ionenkanäle, die bisher entdeckt wurden. Nach ihrer Entdeckung 2002 wurde bald erkannt, dass mit ihnen Aktionspotentiale in Nervenzellen durch Licht ausgelöst werden können. Da KR eine zyklische Reaktion durchlaufen, die nichtinvasiv durch Licht ausgelöst wird und größere strukturelle Veränderungen umfasst, eignen sie sich ideal um an ihnen Struktur-Funktions-Zusammenhänge biophysikalisch zu ergründen. In dieser Arbeit wurden drei aktive KR-Cysteinvarianten hergestellt, die spezifisch an dem zytosolischen Ende der Helix B und zusätzlich an Helix C oder F markiert werden können. Die markierten Positionen können im Grundzustand oder im akkumulierten offenen Zustand, P3, untersucht werden. Die KR-Varianten wurden spinmarkiert und in gepulsten Elektronendoppelresonanzmessungen untersucht. Die Messungen belegen eine Auswärtsbewegung der zytosolischen Seite von Helix B und F im offenen Zustand. Auch im desensitivierten Zustand, P4, bleibt Helix B nach außen versetzt. Die Ergebnisse untermauern die Hypothese einer Tunnelöffnung zwischen den Helices A, B, C und G. Gleichzeitig deuten die Resultate darauf hin, dass die großen Konformationsänderungen, wie bereits vermutet, zu einem gewissen Grad von der Tunnelöffnung entkoppelt sind, da Helix B auch im desensitivierten Zustand nach außen versetzt bleibt. Weiterhin wurde die Grundlage für eine quantitative Bestimmung der Helix F Bewegung bereitet, welche ein weiterhin laufendes Projekt ist. Die Ergebnisse dieser Arbeit werden helfen Modelle des offenen Kanals zu entwickeln und zu beurteilen.