Funktionelle Charakterisierung dendritischer Zellen unter entzündlichen Bedingungen in vitro und Integration in humane Vollhautäquivalente

Abstract

Dendritische Zellen stellen eine morphologisch sowie funktionell heterogene Population professioneller antigenpräsentierender Zellen dar und agieren als Bindeglied zwischen angeborener und erworbener Immunität. Inwiefern die verschiedenen Subtypen auf die Vielzahl unterschiedlicher Einflüsse reagieren, wird von der spezifischen Expression essentieller Mustererkennungsrezeptoren sowie der jeweiligen Lokalisation im menschlichen Körper festgelegt. Inwiefern hierdurch das Verhalten unter akut- bzw. chronisch-entzündlichen Bedingungen beschrieben wird, bleibt jedoch umstritten, da freigesetzte pro- inflammatorische Mediatoren modulatorisch auf die Funktionalität der DC wirken können. Entsprechend der Zielsetzung der vorliegenden Arbeit wurde die Fragestellung zur Reaktivität humaner DC Populationen unter entzündlichen Bedingungen anhand ex vivo differenzierter Subtypen untersucht. Während MoDC, entsprechend der Bedeutsamkeit dermaler DC in der Abwehr invasiver Bakterien, eine hohe Reaktivität gegenüber TLR2/1- und TLR4-Agonisten zeigten, zeigte sich eine mögliche Beteiligung epidermaler LC an der Regulation einer anti- bakteriellen Th17-Antwort in Anwesenheit pro-inflammatorischer Stimuli und steht somit ggf. in direktem Zusammenhang mit der Pathogenese inflammatorischer Hauterkrankungen. Die notwendige Sekretion immunregulatorischer Zytokine, welche u.a. die Differenzierung in verschiedene Th Subtypen steuert, steht auch in komplexer Wechselwirkung mit den konservierten Prozessen der Autophagie. Gemäß der Zielsetzung der vorliegenden Arbeit dienten Inhibitoren definierter Prozesse der Autophagozytose der Evaluation möglicher Modulationen der angeborenen und adaptiven Immunität. Während sich in Anwesenheit von Chloroquin die Freisetzung von IL-12 reduzierte und gleichzeitig MoLC eine geringere Kapazität der Stimulation einer adaptiven Th1-Antwort aufwiesen, zeigte sich nach Aktivierung mit IL-1 eine erhöhte Produktion und Sekretion von IL-6, wobei ausschließlich MoLC auch die Sekretion des Th17-spezifischen Zytokins IL-23 erhöhten. Diese Arbeit verweist daher auf eine mögliche regulative Funktion der Autophagie im Rahmen inflammatorischer Prozesse und stellt insbesondere epidermale LC in den Fokus einer vermuteten Dysregulation der Aktivität effektorischer Th17-Zellen während der Therapie mit Chloroquin. Den ethischen Grundsätzen der 3R-Regel zu Reduktion (reduce), Ersatz (replace) und Verbesserung (refine) von experimentellen Tierversuchen entsprechend wurde zudem die Etablierung einer Alternativmethode zur prädiktiven Identifizierung allergisierender Substanzen gefördert. Tatsächlich gelang im Rahmen dieser Arbeit die Inkorporation unreifer MoLC in in vitro generierte humane Vollhautäquivalente. Inwiefern die inkorporierten Zellen auch immunologische Funktionalität beweisen und die Aktivierung sowie Migration nach gezielter Allergenexposition induzieren, werden zukünftige Studien evaluieren.

Dendritic cells represent a morphologically and functionally heterogeneous population of professional antigen presenting cells and act as a link between innate and adaptive immune responses. The specific reactivity of the distinct DC subtypes against harmful foreign antigens is defined by the unique expression of pattern recognition receptors and their localization in the human body. How far these properties comprise the immunological fate of skin resident DC subsets under inflammatory conditions is questionable, due to the modulatory impact of pro-inflammatory cytokines, which in turn alter the activation and maturation of DC. The selective stimulation with microbial TLR agonists in presence or absence of TNF-α and IL-1β enabled a simulation of steady-state or inflammatory conditions and revealed a distinct disparity in the specific reactivity of both subsets towards microbial stimuli. Thus, this study refers to a possible conversion of the immunogenic characteristics of human DC populations, dependent on the respective skin environment. Considering the diverse functional properties of DC, their specific contribution in the induction, regulation or aggravation of inflammatory skin disorders, such as psoriasis vulgaris, is still poorly understood. The release of pro-inflammatory cytokines, mediating the priming and proliferation of specific Th subtypes, is strongly regulated by the mechanisms of autophagy. Therefore, different inhibitors of autophagy were used to evaluate possible variations in the mediation of innate or adaptive immunity by MoDC and MoLC. Lysosomotrophic agents, like chloroquine, suppressed the process of the late phase of autophagy, and additionally have led to a sustainable dysregulation of cytokine release by activated DC. Whilst the secretion of IL-12 was reduced in both subsets and consequently MoLC revealed a decrease in Th1 priming capacity, the activation with IL-1 together with chloroquine mediated an enhanced secretion of IL-6, mainly by MoDC, whereas MoLC highly induced the release of IL-23. Thus, the current thesis highlights DC as potential critical mediators of Th17 activity during treatment with the anti-malarial agent chloroquine. In agreement with the ethical principle of the 3R concept, which includes the reduction, replacement and refinement of animal testing procedures in industry and science, the concurrent incorporation of immature MoLC within the reconstructed epidermis of a full thickness skin equivalent possibly serves as an alternative method for the predictive assessment of chemical sensitizers in future. Indeed, the integration of immature MoLC into a reconstructed skin equivalent was successful, thus future studies will have to analyze the functional properties of the test system.