The HOX genes encode an evolutionary conserved family of transcription factors playing an important role in embryonic development. In particular, the posterior HOXD genes are involved in limb patterning in higher vertebrates. Different HOXD mutations are associated with limb anomalies in humans and in mice. One of them, synpolydactyly (SPD), a severe dominant disorder characterised by digit duplications and webbing, has been connected to various mutations within the HOXD13 gene. In this study the chromosome translocation t(2;10)(q31.1;q26.3) present in a male patient with mental retardation and SPD was investigated. The breakpoints were mapped and cloned using cytogenetic and molecular approaches. The results indicated that on chromosome 10, MGMT, a gene coding for a DNA-repair enzyme has been disrupted. However, up to now there is no link between this gene and limb development, suggesting that MGMT is not responsible for the skeletal abnormalities present in the patient. On chromosome 2, the breakpoint occurred approximately 390 kb centromeric to the HOXD complex and did not truncate any known gene. However, it has been recently shown that changes in the global chromosomal environment might lead to misregulation of gene expression by so-called position effects. Therefore, it is likely that the translocation affected the precise regulation of HOXD expression resulting in their loss of function and leading to limb abnormalities in the patient. In order to find new players involved in distal limb patterning, I have searched for Hoxd13 interaction partners using the yeast two-hybrid technique. Several candidates were identified and further tested in yeast and mammalian systems. One of them, Peg10 has been shown to co-localise with wildtype and mutant Hoxd13 proteins in COS1 cells. Moreover, binding between these proteins was confirmed in the coimmunoprecipitation assays. Whole mount in situ hybridisation experiments indicated that Peg10 is expressed in distal limb buds during mouse embryogenesis. At the early stages of limb development (E10.5 and E11.5) the Peg10 expression domain overlaps with that of Hoxd13, suggesting that both proteins might interact in vivo. The results presented in this study together with literature data suggest that Peg10 could modulate Hoxd13 function and that both interacting proteins might co-operate in order to regulate transcription of various target genes. However, additional experiments will be necessary to confirm this hypothesis and to explain in detail the role of Hoxd13/Peg10 complexes in vivo. Moreover, it would be interesting to further analyse two other potential Hoxd13 binding partners, Limd1 and Cnot3. Binding assays and functional studies could give us new data valuable for better understanding limb patterning processes.
Die HOX Gene kodieren für eine evolutionär konservierte Familie von Transkriptionsfaktoren, die eine wichtige Rolle während der Embryogenese spielen. Insbesondere sind die posterioren HOXD-Gene an der Ausbildung der Extremitäten beteiligt. Verschiedene HOXD-Mutationen wurden mit Extremitätenfehlbildung bei Mensch und Maus assoziiert. Eine dieser Krankheiten, die Synpolydaktylie (SPD), wird durch verschiedene Mutationen im HOXD13 Gen verursacht. In dieser Studie wurde die Translokation t(2;10)(q31.1;q26.3) in einem männlichen Patienten untersucht. Der Junge ist geistig behindert und zeigt verschiedene Knochenanomalien, inklusive SPD. Die chromosomalen Bruchpunkte wurden kartiert und kloniert. Die Ergebnisse zeigten, dass der Bruchpunkt auf dem Chromosom 10 das MGMT Gen unterbricht. Da dieses Gen für ein DNA-Reparaturenzym kodiert und da es keine Hinweise zu dessen Rolle in der Extremitätenentwicklung gibt, ist es unwahrscheinlich, dass MGMT für die Knochenfehlbildung bei diesem Patienten verantwortlich ist. Der Bruchpunkt auf dem Chromosom 2 wurde ungefähr 390 kb centromerisch vom HOXD-Cluster kartiert. Er unterbricht kein bekanntes Gen. In der letzten Zeit wurde bekannt, dass die Fehlregulation der Genexpression mit einer veränderten chromosomalen Umgebung zusammenhängen kann. Dieses Phänomen wird als Positionseffekt bezeichnet. Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass die Translokation die präzise Regulation der HOXD Gene beeinflusst hat. Dies könnte zum Verlust der HOXD Funktion und zum SPD-Phänotyp im Patienten führen. Um neue Moleküle zu identifizieren, die an Extremitätenentwicklung und Pathogenese beteiligt sind, habe ich nach Hoxd13-Interaktionspartnern mit Hilfe der Hefe-2-Hybrid-Methode gesucht. Einer der Kandidaten, Peg10, kolokalisiert mit den Wildtyp- und den mutanten Hoxd13-Proteinen in COS1-Zellen. Zusätzlich wurde die Bindung zwischen Peg10 und Hoxd13 Proteinen durch Koimmunopräzipitationsstudien nachgewiesen. Die Ergebnisse der Whole mount in situ Hybridisierung zeigten, dass Peg10 während der Mausembryogenese in den distalen Teilen der Extremitätenknospen exprimiert wird. Die Expressionsdomänen von Peg10 und Hoxd13 überlappen sich in den frühen Stadien der Extremitätenentwicklung (E10.5 und E11.5). Das deutet darauf hin, dass die beiden Proteine in vivo interagieren könnten. Die Ergebnisse dieser Studie, zusammen mit bereits publizierten Daten, lassen vermuten, dass Peg10 die Funktion von Hoxd13 moduliert und dass die beiden Proteine die Transkription von verschiedenen Zielgenen regulieren. Weitere Experimente sind nötig, um diese Hypothese zu bestätigen und die genaue Rolle der Hoxd13/Peg10 Komplexe in vivo zu klären. Zwei andere Kandidaten für Hoxd13-Bindungspartner, Limd1 und Cnot 3, sollten weiter untersucht werden, um ihre möglichen Interaktionen mit Hoxd13 zu bestätigen. Die funktionellen Analysen der Kandidatengene könnten zum besseren Verständnis der molekularen Grundlagen der Extremitätenentwicklung beitragen.
