Aufklärung der Funktion von E-Cadherin in der Pluripotenz und Reprogrammierung somatischer Zellen

Abstract

Die Prozesse der frühen Embryogenese sind abhängig von der streng kontrollierten Expression von Zelladhäsionsmolekülen. Besonders die Expression des zur Familie der Cadherine gehörenden Moleküls E-Cadherin ist entscheidend für die Bildung der kompakten Morula, ein frühes Stadium der Embryonalentwicklung, aus der sich die Blastozyste bildet. Die Blastozyste enthält die innere Zellmasse (ICM), eine Ansammlung pluripotenter Zellen, die nicht nur alle Zellen des späteren Embryos bilden, sondern, aus denen in vitro auch embryonale Stammzellen (ES-Zellen) abgeleitet werden können. Embryonale Stammzellen stellen ein in vitro Modellsystem dar, dass Einblicke in diese frühen Differenzierungsprozesse ermöglicht und, wie die Zellen der ICM, einen hohen Expressionslevel von E-Cadherin sowie der Pluripotenzmarker Oct4 und Nanog zeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von E-Cadherin in murinen embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) und im Prozess der Reprogrammierung somatischer Zellen untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass E-Cadherin nicht nur für die Morphologie von mES-Zellen essentiell ist. Eine starke Reduktion des E-Cadherin Levels in mES-Zellen führte zu deren Differenzierung sowie zu einer damit verbundenen Reduktion der Expression der Pluripotenzgene Oct4 und Nanog. Weiterhin konnte durch die Verwendung des Cre/loxP Systems gezeigt werden, dass die Störung der E-Cadherin bzw. beta- Catenin Expression während der OSKM (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc)-induzierten Reprogrammierung zu einer starken Reduktion der Bildung von iPS-Kolonien führte. Die Etablierung des E-Cadherin/beta-Catenin Komplexes ist somit ein entscheidender Schritt während der Konvertierung von Fibroblasten zu iPS- Zellen. Obwohl die E-Cadherin vermittelte Zelladhäsion nicht unmittelbar mit der Regulation von Oct4 beteiligt zu sein scheint, führte die Überexpression von E-Cadherin in Kombination mit SKM, bemerkenswerterweise zur Bildung stabiler ESKM-iPS Klone. Die aus den Klonen erhaltenen iPS Zellen exprimierten endogene Level von Oct4 und Nanog, obwohl Oct4 nicht als exogener Faktor während der Reprogrammierung anwesend war. Weiterhin konnten die ESKM-iPS Zellen durch die Bildung von Embryoid Bodies und Teratomen differenziert werden und daher alle Eigenschaften von mES-Zellen. Durch diese unkonventionell erzeugten iPS-Zellen wird deutlich, dass Pluripotenz neben der transkriptionellen Regulation auch über die Etablierung von Zelladhäsions- verbindungen definiert werden kann. Vor allem die E-Cadherin vermittelte Zelladhäsion übernimmt für die Etablierung und die Erhaltung des pluripotenten Status eine Schlüsselfunktion.

During early embryogenesis the expression of cell adhesion molecules and the establishment of cell-cell contacts are crucial steps to ensure proper development of the embryo. Especially expression of the molecule E-Cadherin, a member of the cadherin superfamily, is crucial for the formation of the compacted morula, comprising an early stage of embryogenesis that forms the blastocyst. The latter bears the inner cells mass (ICM), a group of pluripotent cells, that forms all cells of the adult body. Cells of the ICM can be used to establish embryonic stem cells (ESCs) as an in vitro system that allows providing insights in these early differentiation processes. Embryonic stem cells like cells of the ICM display high expression levels of E-Cadherin and of the pluripotency markers Oct4 and Nanog. In the present work, the function of E-Cadherin in murine embryonic stem cells and during the process of somatic cell reprogramming was analysed. It could been shown in a shRNA mediated knock-down of E-Cadherin that its expression not only determines the morphology of ESCs but is also linked to regulation of the pluripotency genes Oct4 and Nanog. Further, cre/loxP mediated ablation of E-cadherin and beta-catenin expression followed by the reprogramming with four viral factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc (OSKM) led to a strong reduction in the number of induced pluripotent stem cell (iPS-cell) colonies. Therefore, the establishment of the E-Cadherin/beta-Catenin complex is a crucial step in the process that governs the conversion of fibroblasts to iPS-cells. Although the link between E-Cadherin mediated cell adhesion and the regulation of Oct4 seems to be indirect, overexpression of E-cadherin in combination with SKM surprisingly, led to the formation of stable ESKM-iPS clones. Cells of these clones displayed endogenous expression of Oct4 and Nanog although exogenous Oct4 was absent during the reprogramming process. Established ESKM-iPS cells fulfilled all criteria tested so far, to establish their pluripotent state. ESKM-iPS cells were able to undergo embryoid body mediated differentiation and formed teratoma. The generation of these unconventional generated iPS cells points out that pluripotency, beside transcription factors, is also defined by the adhesive integrity of iPS and ES-cells. Especially E-Cadherin mediated cell adhesion plays a crucial for the establishment and maintenance of the pluripotent state.