Der GDF5/BMPR1B-Signalweg spielt eine essentielle Rolle während der Embryonalentwicklung, insbesondere bei der Ausbildung der distalen Extremitätenabschnitte. GDF5 ist ein Mitglied der TGFβ-Superfamilie und beeinflusst als sezerniertes Protein die Musterbildung der Finger und der Gelenke. Mutationen in GDF5 und dem GDF5-responsiven Rezeptor BMPR1B führen zu verschiedenen Typen von Brachydaktylien, die durch eine Verkürzung der Phalangen und eine Fehlentwicklung von Gelenken gekennzeichnet sind. Ziel dieser Doktorarbeit ist eine funktionelle in vitro Analyse und eine Genotyp- Phänotyp Korrelation von neu identifizierten Mutationen in GDF5 (R438L, L441P, N445T) und BMPR1B (I200K, R486W), deren molekulare Effekte unbekannt sind bzw. die zu untypischen Phänotypen bei den Patienten führen. Die durchgeführten Analysen zeigten, dass BMPR1B-Mutationen zu einer BDA2 führen können, wenn die Signalweiterleitung durch die Kinasedomäne des Rezeptors oder der Rezeptor turnover gestört ist. Ein ähnlicher Phänotyp resultiert bei der L441P Mutation in GDF5, welche die Rezeptorinteraktion negativ beeinflusst. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass sowohl der proximale Symphalangismus als auch das multiple Synostose Syndrom nicht ausschließlich durch Mutationen im NOG- Gen hervorgerufen werden, sondern ebenso aus einer gestörten NOG-GDF5 Wechselwirkung oder durch ein aktivierendes GDF5 resultieren können. Durch die Analysen der identifizierten Missense-Mutationen in BMPR1B bzw. GDF5 konnten spezifische Protein-Protein Interaktionen aufgeklärt werden, wie z.B. neue Details zur BMPR1B-Aktivierung durch GDF5 oder zur Wechselwirkung von GDF5 mit dem Antagonisten NOG. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse eröffnen somit grundlegende Erkenntnisse über die zentrale Rolle von GDF5 und BMPR1B im Regelnetzwerk der frühembryonalen Knochenentwicklung. Die hier untersuchten Mutationen erweitern das Wissen von GDF5-abhängigen Phänotypen. Mutationen in unterschiedlichen Genen des gleichen Signalweges können identische Phänotypen hervorrufen, wenn sie ähnliche Effekte auf die Protein-Protein Interaktionen haben.
The Growth and Differentiation Factor 5 (GDF5) is a secreted signaling molecule that belongs to the TGFb superfamily. GDF5 has an essential function during embryonic development, especially during the formation of the distal limbs. GDF5 signals via binding to its cognate receptor Bone Morphogenetic Protein Receptor 1B (BMPR1B) and determine pattern formation in the developing hand. Mutations in GDF5 or BMPR1B cause different types of hand malformations, which are characterized by shortening of the phalanges and deviations of the finger joint regions. This PhD thesis is devoted to the functional in vitro analysis and genotype-phenotype correlation of newly identified mutations in GDF5 (R438L, L441P, N445T) and BMPR1B (I200K, R486W). The molecular effects of these mutants were unknown and/or have led to atypical phenotypes in the patients. Functional analyses with a micromass culture system revealed a strong inhibition of chondrogenesis by both mutant receptors. These findings imply that both mutations identified in human BMPR1B affect cartilage formation in a dominant-negative manner. The L441P mutation in GDF5 causes a similar phenotype presumably because of a significantly reduced interaction with BMPR1B. Moreover, proximal symphalangism and the multiple synostosis syndrome, which were previously only associated with mutations in NOG, could be identified in patients with point mutations in GDF5. Here, the interaction of the GDF5 mutants with the inhibitor NOG were either disturbed or the mutant GDF5 displayed an additional activity by also binding to BMPR1A. The presented experiments with the newly identified mutations in GDF5 and BMPR1B have identified some of the main determinants of GDF5 for specific protein-protein interactions. Molecular details about the functional domains of GDF5 became apparent, e.g. the identification of those interfaces that are important for receptor binding specificity or for the GDF5-NOG interaction. Thus, these results broaden our understanding on the importance of GDF5 and BMPR1B during the complex process of early bone development. The analyzed mutations expand the knowledge about GDF5-dependent phenotypes, i.e., mutations in GDF5 or its interaction partners BMPR1B and NOG, respectively, can cause identical phenotypes if they impair their protein-protein interactions.
