Validierung eines ELISAs zur Messung des felinen Haptoglobins und Untersuchung der Bedeutung von Akute-Phase-Proteinen als Biomarker bei erkrankten Katzen

Abstract

Bei der Katze zählen das saure α1-Glykoprotein (AGP), Serum-Amyloid-A (SAA) und Haptoglobin (Hp) zu den Akute-Phase-Proteinen (APPs). Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war die objektive Validierung eines Sandwich-ELISAs zur Messung des felinen Hp. Das zweite Ziel umfasste die Untersuchung und Evaluierung von AGP, SAA und Hp als Indikatoren hinsichtlich Diagnostik und Monitoring bei an einer obstruktiven Form der unteren Harnwegserkrankung (obstruktive FLUTD) und an Diabetes mellitus (DM) erkrankten Katzen. Es wurden Serumproben von 56 Katzen gesammelt, welche in einem Zeitraum von Juni 2012 bis Januar 2014 an der Klinik für kleine Haustiere, Freie Universität Berlin, vorgestellt wurden. Die Validierungsstudie des Hp-ELISAs beinhaltete die Erhebung der Präzision und der Richtigkeit, der Nachweisgrenze, einen Methodenvergleich mit einem spektrophotometrischen Assay sowie eine Overlap Performance. Die klinische Studie umfasste die Ermittlung von Referenzintervallen für AGP, SAA und Hp bei gesunden Katzen sowie die Messung dieser 3 APPs bei erkrankten Katzen mit obstruktiver FLUTD und DM. Von den erkrankten Katzen wurden Proben am Tag der Erstvorstellung und bei folgenden Kontrolluntersuchungen gewonnen. Die an obstruktiver FLUTD erkrankten Patienten wurden hinsichtlich der Diagnose weiterer Erkrankungen im Behandlungszeitraum und die an DM erkrankten Katzen bezüglich der Diagnose einer hochgradigen Ketose oder diabetischen Ketoazidose in je 2 Gruppen unterteilt. Die Ergebnisse der Validierungsstudie ergaben Intra- und Inter- Assay-Variationskoeffizienten von 2,5% bis 4,7% bzw. 7,1% bis 11,6%, Wiederherstellungsraten von 108,1% bis 118,4% sowie Wiederfindungsraten von 90,8% bis 94,0%. Die Nachweisgrenze betrug 0,19 mg/ml. Im Methodenvergleich konnte eine sehr starke positive Korrelation und ein proportionaler Bias von -38,9% zwischen beiden Assays festgestellt werden. Die Overlap Performance des ELISAs war zufriedenstellend. Zusammenfassend wies der Sandwich-ELISA eine akzeptierbare analytische und klinische Performance auf. Jedoch sollte ausschließlich der ELISA oder der spektrophotometrische Assay verwendet werden. In der klinischen Studie waren am Tag der Erstvorstellung die AGP- und SAA-Konzentrationen der Gruppen FLUTDunkompliziert, FLUTDkompliziert und DMkompliziert signifikant im Vergleich zu den gesunden Katzen erhöht. Für Hp wurden signifikante Konzentrationserhöhungen im Vergleich zu den gesunden Katzen bei den Gruppen FLUTDkompliziert, DMunkompliziert und DMkompliziert nachgewiesen. Durch Auswertung der Verlaufsmessungen wurde eine gute Übereinstimmung der klinischen Entwicklung der Patienten mit den APP- Konzentrationsverläufen aufgezeigt. Die kleine Studienpopulation stellte eine wichtige Limitation der vorliegenden Arbeit dar. Zusammenfassend können AGP, SAA und Hp bei an obstruktiver FLUTD und an DM erkrankten Katzen als Biomarker hinsichtlich Diagnostik und Monitoring Anwendung finden.

In cats, α1-acid glycoprotein (AGP), serum amyloid A (SAA), and haptoglobin (hp) are recognized as acute phase proteins (APPs). The first aim of this study was to objectively validate a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measurement of feline hp. The second aim was to examine and evaluate the use of AGP, SAA, and hp as diagnostic indicators and parameters for monitoring in cats with an obstructive urinary tract disease (obstructive FLUTD) and diabetes mellitus (DM). Serum samples were obtained from 56 cats from June 2012 until January 2014 at the Clinic of Small Animals, Freie Universität Berlin. The validation study of the ELISA for measurement of hp included an assessment of precision and accuracy, detection limit, method comparison with the spectrophotometric assay, and evaluation of the overlap performance. The clinical study comprised the establishment of reference intervals for AGP, SAA, and hp in healthy cats as well as measurements of these 3 APPs in diseased cats diagnosed with obstructive FLUTD and DM. Cats with obstructive FLUTD were subdivided based on the diagnosis of concurrent disorders during treatment. Cats with DM were classified according to the diagnosis of a severe ketosis or diabetic ketoacidosis. The results of the validation study revealed coefficients of variation from 2.5 to 4.7% for intra-assay variability and from 7.1 to 11.6% for inter-assay variability. The ratio of observed to expected dilutional parallelism was 108.1 to 118.4%. The ratio of observed to expected spike recovery was 90.8 to 94.0%. The detection limit was 0.19 mg/ml. Method comparison revealed a strong positive correlation and a proportional bias between the methods of -38.9%. Overlap performance of the ELISA was deemed satisfactory. The commercially available sandwich ELISA measures feline haptoglobin with an analytical and overlap performance acceptable for clinical purposes. Given the observed bias, the ELISA cannot be used interchangeably with the spectrophotometric assay. In the clinical study, on the day of first presentation the levels of AGP and SAA of the groups FLUTDuncomplicated, FLUTDcomplicated, and DMcomplicated were significantly elevated in comparison to concentrations measured in healthy cats. For hp, a significant elevation in concentration in comparison to the healthy cats was detected for FLUTDcomplicated, DMuncomplicated, and Dmcomplicated. The interpretation of the follow-up measurements of each patient showed a good agreement between the response to treatment and the corresponding APP- concentration profiles over time. The small study population was deemed as an important limitation, which was taken into account when interpreting the results of this study. In summary, AGP, SAA, and hp can be used as diagnostic and monitoring biomarkers in cats with obstructive FLUTD and DM.