Modulation of Na and acetate transport by heat shock proteins (Hsp) across the rumen epithelium of sheep

Abstract

It has been known from previous studies that the rumen epithelium can adapt, both morphologically and functionally, to changes in diet. This process may take days or weeks however, a daily variation in ruminal pH, predominantly after meals, has also been documented particularly in case of SARA that causes a low ruminal pH (<5.5) for a period of 3-4 hours per day. This diurnal variation in rumen pH and SCFA concentration puts the rumen epithelium in a stressful scenario and demands a rescue mechanism from these short term challenges. It was therefore, the intention of this study to investigate the protective role of heat shock proteins and NHE in the rumen epithelium exposed on the luminal side to changes of pH, SCFA concentration, temperature or osmotic pressure. Using conventional Ussing chamber technique, in vitro, Na and acetate transport across the rumen epithelium were carried out to evaluate these protective effects whereas, concentrate fed animals with ruminal fermentation pattern resembling SARA were used to study the Hsp70 expression in vivo. The following results were obtained: 1\. Characterization of electroneutral Na transport via NHE clearly showed that the isoform NHE3 is mediating electroneutral Na transport. Application of the specific NHE3 blocker S3226 reduced Jms Na and Jnet, which was not different from Isc, indicating that S3226 abolished electroneutral Na transport. 2\. Incubation of isolated rumen epithelium in the Ussing chamber simulating the conditions of SARA i.e. low mucosal pH (6.4-6.0) and/or high SCFA (70-80mmol·l-1) concentrations, increasing temperature or osmotic pressure induced an over- expression of Hsp70. This expression was reduced when the stress conditions exceeded beyond a certain limit. For instance, an increase in temperature (>44°C), SCFA concentration on mucosal buffer (>100mmol·l-1) and decrease in pH on mucosal side (<5.5) reduced Hsp70 expression. 3\. Hsp70 expression could be reduced using a non specific (cycloheximide) or specific inhibitor (triptolide) thus allowing further studies in the presence or absence of Hsp70. Cycloheximide was most effective in a concentration of 3.0 mmol·l-1 while Triptolide was used in a concentration of 100 nmol·l-1. The use of these inhibitors did not affect the Isc or Gt and Na or acetate flux rates under control conditions. 4\. Electroneutral Na as well as acetate transport were significantly higher in the tissues after an over expression of Hsp70. This increase of flux rates was significantly reduced by treatment with cycloheximide or triptolide. 5\. Induction of Hsp expression by low rumen pH and an increase of temperature was confirmed in vivo by feeding concentrates. The tissues of these sheep exhibited higher Na transport rates. It is concluded that the diurnal variation of fermentation pattern are inducing mechanisms which help to protect the tissue against theses challenges. Hps 70 is obviously an integral part of this acute adaptation and enhances NHE3 activity. Extrusion of protons taken up at increasing rates at higher SCFA concentrations and low pH must be considered as a first line of protection against SARA conditions of the rumen fluid. Although the exact mechanism between Hsp expression and NHE3 activity is not clear, Hsp is obviously a protective mechanism in the rumen epithelium too.

Zahlreiche Studien belegen, dass das Pansenepithel sich sowohl in funktioneller, als auch in morphologischer Hinsicht an Veränderungen in der Fütterung anpassen kann. Dieser Prozess kann Tage oder Wochen dauern; jedoch werden auch kurzfristige tägliche Schwankungen im pH des Pansens beobachtet, welcher insbesondere nach den Mahlzeiten und im Falle von SARA für 3-4 Stunden auf sehr niedrige Werte (<5.5) absinken kann. Diese tägliche Variation im pH Wert und in der Fettsäurekonzentration im Pansen stellt eine starke Belastung für das Pansenepithel dar und protektive Mechanismen sind erforderlich, um diesen akuten Belastungsschüben zu begegnen. Es war daher die Absicht dieser Studie, die Schutzfunktion eines Heat Shock Proteins (Hsp70) und des NHEs an Epithelien des Pansens zu untersuchen, welche auf der mukosalen Seite Veränderungen im pH, in der Konzentration kurzkettiger Fettsäuren, in der Temperatur oder dem osmotischen Druck ausgesetzt worden waren. Um die protektive Funktion dieser Proteine zu untersuchen, wurde der Transport von Na und Azetat über das Pansenepithel in konventionellen Untersuchungen in der Ussingkammer in vitro gemessen. Begleitend wurde an Tieren, bei welchen durch Konzentratfütterung im Pansen SARA-ähnliche Fermentationsbedingungen induziert worden waren, die in vivo Expression von Hsp70 untersucht. Die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: 1\. Die Charakterisierung des elektroneutralen Natriumtransportes durch NHE zeigte klar, dass die Isoform NHE3 den elektroneutralen Natriumtransport vermittelt. Applikation des spezifischen NHE3 Blockers S3226 reduzierte Jms Na und Jnet, welche sich danach nicht signifikant vom gleichbleibenden Isc unterschieden. Dieses weist darauf hin, dass S3226 den elektroneutralen Natriumtransport hemmt. 2\. Die Inkubation von isoliertem Pansenepithel in der Ussingkammer unter SARA ähnlichen Bedingungen mit niedrigem pH (6.4-6.0) und/oder hoher Konzentration kurzkettiger Fettsäuren (70-80 mmol·l-1), ansteigender Temperatur oder Zunahme des osmotischen Druckes induzierte eine Überexpression von Hsp70. Diese Expression wurde reduziert wenn die Stressoren ein bestimmtes Maß überschritten. So kam es z.B. bei einer Zunahme der Temperatur >44ºC, einer Konzentration von kurzkettigen Fettsäuren >100 mM und einem Abfall des pHs auf der mukosalen Seite >5.5 zu einem Abfall der Hsp70 Expression. 3\. Die Expression von Hsp70 konnte durch einen nicht-spezifischen (Cycloheximid) oder spezifischen (Triptolid) Inhibitor abgesenkt werden, wodurch weitere Untersuchungen in der Anwesenheit und Abwesenheit von Hsp70 ermöglicht wurden. Cycloheximid war am effektivsten in einer Konzentration von 3.0 mmol·l-1, während Triptolid in einer Konzentration von 100 nmol·l-1 eingesetzt wurde. Unter Kontrollbedingungen hatte der Gebrauch dieser Inhibitoren weder auf den Kurzschlussstrom (Isc) noch auf die Leitfähigkeit (Gt), die Na- oder die Azetatfluxe einen Einfluss. 4\. Der elektroneutrale Transport von Na und der Transport von Azetat waren signifikant höher nach Überexpression von Hsp70. Diese Zunahme der Fluxraten wurde durch die Behandlung mit Cyclohexamid oder Triptolid signifikant reduziert. 5\. Die Induktion von Hsp70 Expression in vivo durch einen niedrigen pH des Pansens und durch eine Zunahme der Temperatur wurde durch die Untersuchung von Geweben von Schafen mit unterschiedlicher Fütterung bestätigt. Epithelien von Schafen, die eine hohe Kraftfutterration erhalten hatten, zeigten auch höhere Na Transportraten. Diese Ergebnisse führen zu der Schlussfolgerung, dass die tägliche Variation des Fermentationsmusters Mechanismen induziert, die das Gewebe vor der damit verbundenen Belastung schützt. Die Induktion von Hsp70 ist offenbar ein integraler Bestandteil dieser akuten Anpassungsreaktion und erhöht die Aktivität des NHE. Die Ausschleusung von Protonen, die mit zunehmender Fettsäurekonzentration und sinkendem pH vermehrt aufgenommen werden, muss als eine erste Schutzmaßnahme gegen die bei SARA vorherrschenden Bedingungen in der Pansenflüssigkeit gelten. Obwohl die genaue Natur des Zusammenhangs zwischen Hsp Expression und NHE3 Aktivitität nicht klar ist, stellen Hsp offenbar einen protektiven Mechanismus im Pansenepithel dar.