Phytochemische und pharmazeutisch-biologische Untersuchungen an der aztekischen Süßpflanze Lippia dulcis Trev.

Abstract

Lippia dulcis Trev. ist eine Arzneipflanze von der Familie Verbenaceae. Sie enthält das süß schmeckende Sesquiterpen (+)-Hernandulcin, welches um ein Vielfaches süßer als Saccharose ist. In der vorliegenden Arbeit wurden L. dulcis Pflanzen aus verschiedenen Regionen morphologisch, phytochemisch, biologisch und pharmakologisch charakterisiert. Die morphologischen Merkmale der Pflanze wurden mit Hilfe der Lichtmikroskopie untersucht. Die meisten Sekretionsstrukturen dieser Pflanze befinden sich auf den Blüten und Blättern. Das ätherische Öl wurde aus der Pflanze mittels Wasserdampfdestillation gewonnen. Die Hauptbestandteile des ätherischen Öls (Campher und Hernandulcin) wurden mittels HPLC und GC quantitativ analysiert. Trotz der gleichen morphologischen Eigenschaften der Pflanzen zeigten sie Unterschiede in der Öl- Ausbeute und –Zusammensetzung. Die Zytotoxizität des ethanolischen Extrakts, der ätherischen Öle, des Hernandulcins und des Camphers wurden an den Leberkrebszellen HepG2 getestet. Die IC50-Werte wurden bestimmt. Die ätherischen Öle und Hernandulcin zeigten eine konzentrations- und zeitabhängige Hemmung auf die Prolieferation der HepG2-Zellen. Die Reduzierung der Zellzahlen und die Zerstörung der Monolayer der mit o.g. Substanzen (IC50) behandelten Zellen konnte mittels Hämatoxylin-Färbung beobachtet werden. Der Ethanol-Extrakt und der Campher zeigten keine Wirkungen auf die Zellproliferation. Der genaue Mechanismus des Zelltods durch ätherische Öle und Hernandulcin wurde mittels AO/EB-Färbung, DNA-Leiter-Test, LDH-Assay und Messung der mitochondrialen Aktivität ermittelt. Mittels AO/EB Färbung zeigten Zellen, die mit hohen Substanzkonzentrationen behandelt wurden, die typischen morphologischen Merkmale der Apoptose. Die o.g. Testsubstanzen verursachten eine dosis- und zeitabhängige DNA-Fragmentierung. Beim LDH-Assay kam es zu keiner signifikanten LDH-Freisetzung aus den nekrotischen Zellen. Die Versuchsubstanzen reduzierten die mitochondriale Aktivität der Zellen in einer dosisabhängigen Weise. Die Testsubstanzen zeigten in hohen Konzentrationen Zytotoxizität und induzierten hauptsächlich Apoptose in HepG2-Zellen. Die Mutagenität des Öls und des Hernandulcins wurde in vitro auf HepG2-Zellen untersucht. Die Bestimmung der Ku-Protein-Expression nach der Behandlung mit der Testsubstanz wurde mittels ELISA und Western Blot durchgeführt. Unsere Untersuchungen ergaben keinen eindeutigen Hinweis auf Mutagenität durch die Pflanzensubstanzen. Zur Beurteilung der traditionellen Verwendung von L. dulcis gegen Husten, wurden in dieser Arbeit die pharmakologischen Merkmale der Pflanze in vitro untersucht. Die antiinflammatorische Wirkung wurde an Hand der Verminderung der Elastase-Aktivität (EC 3.4.21.37) untersucht. Eine deutliche Beeinflussung der Aktivität der humanen neutrophilen Elastase durch den ethanolischen Extrakt von L. dulcis konnte festgestellt werden. Die spasmolytischen Effekte der ätherischen Öle wurden an isolierten glatten Muskeln (Schweinebronchien und Rattentrachea) in vitro untersucht. Das ätherische Öl aus Mexiko zeigt eine spasmolytische Wirkung auf schweinische Bronchialsegmente gegen Carbachol und Histamin und verursachte eine leichte Erhöhung in der mukoziliären Clearance MCC in der Rattentrachea. Das Öl wirkte als nicht kompetitiver Antagonist. Dagegen zeigte das Öl aus Mexiko keine Verminderung der BaCl2-induzierten Kontraktionen.

Lippia dulcis Trev. is a medicinal plant from the family Verbenaceae and contains the sweet sesquiterpene (+)-hernandulcin, which was judged to be more than three orders of magnitude sweeter than sucrose. In this work, L. dulcis plants from different regions were characterized morphologically, phytochemically, biologically and pharmacologically. The morphological investigations by light microscope showed that secretory structures of these plants were more abundant on flowers and leaves. The essential oil was isolated from the plants by steam distillation and its main components (camphor and hernandulcin) were quantitatively analyzed using HPLC and gas chromatography. These populations differed in essential oil yield and compostion in spite of their morphological similarity. The cytotoxicity of the ethanolic extract, essential oils, hernandulcin and camphor was examined in human hepatocellular carcinoma cell line (HepG2) and their IC50 values were determined. The essential oils and hernandulcin had antiproliferative activity on HepG2 cells in a concentration- and time-dependent manner. Reduction of HepG2 cell populations and destruction of monolayer were observed in cells stained with hematoxylin after treatment with the above mentioned substances (IC50). However, the ethanolic extract and camphor exhibited no signifikant effects on cell proliferation. The mechanism of cell death by essential oils and hernandulcin was ascertained using AO/EB double staining, DNA ladder assay, LDH assay and the measurment of mitochondrial activity. After AO/EB staining, cells treated with high concentration of substances showed typical morphologic features of apoptosis. Essential oils and hernandulcin induced ladder-like DNA fragmentation in cells in dose- and time-dependent manners. These DNA ladders appeared in cells following exposure to higher concentrations of substances. LDH assay revealed no significant increase in LDH leakage from necrotic cells. The tested substances reduced the mitochondrial activity of treated cells in dose-dependent manner. These test substances showed cytotoxicity at higher concentrations and induced mainly apoptosis in HepG2 cells. The mutagenicity of essential oils and hernandulcin was evaluated in vitro in HepG2 cells. Expression of Ku proteins in the cells after exposure to test substances was assessed immunologically by ELISA and western Blot analysis. The results of this assay indicated no evidence of mutagenicity for the tested substances. In this work, the pharmacological features of L. dulcis were investigated in vitro in order to evaluate its traditional uses against respiratory tract disorders. The anti-inflammatory activity was assessed by the inhibition of human neutrophil elastase (EC 3.4.21.37). Results indicated that the activity of elastase is affected only by the ethanolic extract. The antispasmodic effects of essential oils were investigated in vitro using isolated smooth muscle (porcine bronchia and rat trachea). The mexican essential oil showed antispasmodic activity on bronchial segments of pigs against carbachol and histamine and caused a slight increase in mucociliary clearance MCC in rat trachea. Thus, the mexican oil behaves just like a noncompetitive antagonist. However, the mexican oil don’t inhibited the contractions of the trachea that were induced by barium ions.