Gewinnung zweier monoklonaler Antikörper gegen Proteine des colorectalen Carcinoms

Abstract

Einleitung: Die Qualität immundiagnostischer und -therapeutischer Verfahren zur Behandlung von Tumorerkrankungen hängt entscheidend von Spezifität und Sensitivität der verwendeten Antikörper ab. Ziel war hier die Etablierung neuer monoklonaler Antikörper gegen antigene Proteine aus Membranen von Coloncarcinomzellen. Die Antigene sollten im Gewebe lokalisiert, chromatographisch angereichert und proteinbiochemisch charakterisiert werden. Ergebnisse: Nach Immunisierung von Mäusen mit Membranproteinen aus humanen Coloncarcinomen wurden durch Hybridisierung und Klonierung antikörperproduzierende Zellklone gewonnen. Aufgrund von Affinitätsvergleichen im ELISA mit Präparationen aus Carcinom- und Normalgewebe wurden tumorspezifische Klone selektiert. Die erkannten antigenen Proteine wurden in Coloncarcinom-Membransolubilisaten mittels Western-Blot nachgewiesen. Zwei Antikörper mit besonders hoher Spezifität wurden näher untersucht. MAK 03.1.1 erkannte im Western-Blot eine Proteinbande mit einem relativen Molekulargewicht von 143kD. Das Antigen wurde über mehrere Stufen mittels HPLC angereichert. Tryptische Peptide dieses Proteins wurden mit RP-HPLC getrennt und durch Massen-spektrometrie (MALDI-TOF MS) und N-terminale Sequenzierung analysiert. Die erhaltene N-terminale Sequenz der a1-Kette von Kollagen I erklärt das Bild der im Vorfeld angefertigten Immunhistochemischen Schnitte, die eine starke Anfärbung im Bereich der Lam.prop.mucosae zeigten. Der abgebildete Immunoblot zeigt die Spezifität des Anikörpers für Kollagen I bei gleichzeitig leichter Kreuzreaktivität mit Kollagen III. MAK 05.1.14 zeigte im Western-Blot eine inhomogene Bande zwischen 150 und 200kD. Das Antigen wurde durch Immunaffinitätschromatographie angereichert. Aus der Sequenzanalyse ging hervor, dass es sich um ein Mitglied der CEA-Familie (CD66 etc.) handelt. Dementsprechend zeigen sich auch die immunhistochemischen Färbungen mit MAK 05.1.14, bei denen sich das neoplastisch veränderte Colonepithel ubiquitär stark angefärbt darstellt. Nach Abspaltung der N-Glykane konnte das Antigen noch detektiert werden, nach Abspaltung der Sialinsäuren war das Signal im Immuno-Blot sogar stärker. Diskussion: Mit dem hier beschriebenen Verfahren konnten tumorspezifische monoklonale Antikörper etabliert werden, mit denen nun Korrelationen zwischen Antigenexpression und Lokalisation, Tumorstadium und Prognose untersucht werden können. Die erarbeiteten Verfahren zur Reinigung und Identifizierung der Antigene ermöglichen Untersuchungen zu qualitativen und quantitativen Veränderungen dieser Proteine in Tumoren. Kollagen I und III als Bestandteil des Carcinomstromas spielen eine bedeutende Rolle in der Tumorbiologie. Biochemische Veränderungen der Ketten und Fibrillen sowie pathologische Verteilungsmuster in Gewebeschnitten lassen Schlüsse über Tumororganisation und -malignität zu. Die Etablierung von MAK 05.1.14 belegt die Bedeutung der CEA-Gruppe als Antigene bei maligner Entartung bestimmter Gewebe.

Introduction: The quality of immunodiagnostic and ?therapeutic methods greatly depends on the specificity and sensitivity of the antibodies employed. The objective was to develop new monoclonal antibodies against proteins from colorectal carcinoma cell membranes. The respective antigens should be localized in the tissue, chromatographically accumulated and biochemically analysed. Results: After immunization of mice with membrane-proteins from human colorectal carcinoma, antibody producing hybridoma cell clones were established. After affinity assays were performed with ELISA, two cell clones with the most specific detection of carcinoma tissue compared with normal tissue were selected and further characterized. MAK 03.1.1 detected an antigen with a relative molecular weight of 143kD. The antigen was accumulated after multiple chromatographic steps. Tryptic antigenic peptides were fractioned via RP18-HPLC and analyzed with mass-spectrometry and amino-acid sequencing. The resulting sequence corresponded with the alpha-chain of collagen I and explained the staining of interstitial tissue by the antibody in histological tissue slices. Further investigation proved the detection of collagen I with slight cross-reactivity towards collagen III. MAK 05.1.14 showed an inhomogenic pattern between 150 and 200kD in immunoblot detection. The antigen could be isolated by immuno-affinity chromatography. After sequence analysis, it could be identified as a member of the CEA-family. Correspondingly, immunhistochemistry showed intense staining of colorectal carcinoma cells. After deglycosylation the antigen was still detectable in the immunoblot, desialylation even led to stronger signals. Discussion: With the strategy described above, tumorspecific antibodies can be established. Furthermore it is possible to investigate correlations between expression and localisation of the antigen as well as tumor stage and prognosis. Collagen I and III as parts of the extracellular matrix play an important role in tumorbiology. Biochemical alterations of chains and fibrils as well as pathologic distribution patterns allow conclusions about tumor organisation and malignancy. The establishment of MAK 05.1.14 verifies the importance of CEA as an antigen expressed during neoplastic development.