In vitro selection and characterization of DNA aptamers against a multiple myeloma monoclonal protein

Abstract

Multiple myeloma (MM) is a clonal B cell malignancy. The idiotype (Id) of the monoclonal (M) protein secreted by the tumor cells is a well–defined, tumor–specific marker. Thus, the Id has becomes an intriguing target for the treatment of MM. Aptamers binding to the Id with high affinity and specificity could be very useful in MM diagnosis and therapy. This work focused on the selection and characterization of specific DNA aptamers for a MM IgG1 using the in vitro selection (SELEX) from an initial pool of 3×1015 different ssDNAs with a 50–nt central block of randomized sequence. After nine rounds of selection and amplification, 19 different variants were isolated and 18 of them proved to be target binders. Highly G–rich consensus sequence elements were identified and could be folded into a common stem–loop structure by the Mfold program. CD and UV spectra indicated that the loop forms a G–quadruplex in solution. The best binder MA–01 exhibited a dissociation constant (Kd) of 172 nM. Binding affinities of three truncated versions of MA–01 indicated that the G-quadruplex might be directly involved in target recognition, while the stem was also required for binding. The aptamer was proven to be very specific for the target antibody. The aptamer binds to the variable region of the antibody, or even to the antigen binding pocket of the antibody. The aptamer exhibited high stability in human serum. An aptamer–based ELISA allowed the detection of MM IgG1 in human serum at concentrations as low as 10 nM. In addition, the chromatographic properties of the aptamer were tested. The immobilization of the aptamer did not change the binding ability. Moreover, the aptamer exhibited a pH dependent binding property, which could be used to regenerate the column matrix. The immobilized aptamer could specifically capture MM IgG1 from human serum. Therefore, this work offers the possibility to generate anti–Id aptamers. Such patient and tumor specific aptamers The potential of the aptamer was evaluated for future diagnosis and therapy could have a number of potential implications ranging from diagnosis, apheresis and targeted therapies of B cell malignancies.

Das multiple Myelom (MM) ist eine maligne Erkrankung klonaler B-Zellen. Der Idiotyp (Id) des monoklonalen Antikörpers, der von den Tumorzellen sekretiert wird, ist ein gut definierter, Tumor-spezifischer Marker. Daher wird der Id zu einem interessanten Zielmolekül für die Behandlung von MM. Aptamere, die an den Id mit hoher Affinität und Spezifität binden, könnten sehr nützlich für die Diagnose und Therapie von MM werden. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Selektion und Charakterisierung von spezifischen DNA-Aptameren für ein MM IgG1 mit Hilfe der in-vitro-Selektion (SELEX) aus einem Pool von 3×1015 verschiedenen ssDNAs mit einem zentralen Block von 50 Nukleotiden mit Zufallssequenz. Nach neun Runden von Selektion und Amplifikation wurden 19 verschiedene Varianten isoliert, von denen 18 an das Zielmolekül binden konnten. Eine G-reiche Konsensus-Sequenz wurde identifiziert, die mit dem Mfold-Programm in eine gemeinsame Stem-Loop-Struktur gefaltet werden konnte. CD- und UV-Spektren weisen für den Loop auf die Ausbildung einer G-Quadruplex- Struktur. Der beste Binder MA-01 zeigte ein Dissoziationskonstante (Kd) von 172 nM. Bindungsaffinitäten von drei verkürzten Versionen von MA-01 weisen darauf hin, dass die G-Quadruplex-Struktur direkt mit dem Zielmolekül wechselwirkt, wobei auch der Stem für die Bindung benötigt wird. Es konnte gezeigt werden, dass das Aptamer den Ziel-Antikörper spezifisch erkennt. Das Aptamer bindet in der variablen Region des Antikörpers oder sogar in der Antigen-bindenden Tasche des Antikörpers. Das Potenzial des Aptamers für die zukünftige Diagnose und Therapie wurde evaluiert. Das Aptamer zeigte hohe Stabilität in humanem Serum. Ein Aptamer-abhängige ELISA erlaubt den Nachweis von MM IgG1 in humanem Serum bis zu Konzentrationen von 10 nM. Zudem wurden die chromatographischen Eigenschaften des Aptamers getestet. Die Immobilisierung des Aptamers verhindert nicht die Bindung. Darüber hinaus ist die Bindung abhängig vom pH-Wert, was zur Regenerierung der Säulenmatrix genutzt werden kann. Das immobilisierte Aptamer konnte spezifisch MM IgG1 aus menschlichem Serum entfernen. Diese Arbeit bietet die Möglichkeit, anti-Id Aptamere zu generieren. Diese Patienten- und Tumor-spezifischen Aptamere besitzen eine Mehrzahl potenzieller Anwendungen, wie Diagnose, Apherese und zielgerichtete Therapie von B-Zell-malignen Erkrankungen.