Investigation of the mechanism of action of ursodeoxycholic acid on normal or inflamed epithelia in vivo and on the intestinal epithelial cells in vitro

Abstract

The original objective of this work was to clarify the mechanism of the chemopreventive action of ursodeoxycholic acid (UDCA) in a DSS-colitis mice model. The secondary question was how UDCA acts upon the normal epithelium. Both DSS-colitis mice and normal mice were fed with diet containing UDCA at different concentrations for 86 days and 21 days respectively. The RNA from colonic epithelial cells was used for a microarray experiment to identify proliferation-associated genes. The changes in gene expression were confirmed by real time RT-PCR. The effect on proliferation was assayed by immunohistochemical staining of the colonic sections for Ki-67-expression and BrdU incorporation. The mechanism was investigated in detail in an in vitro model using IEC-6 cell line. DSS-colitis increased the crypt length and the number of proliferating cells per crypt. The treatment of DSS-colitis mice with UDCA decreased the crypt length and the number of proliferating epithelial cells per crypt. Proliferation promoting genes like Gbp2 were identified which were upregulated in DSS-colitis mice and were brought to normal expression levels by UDCA treatment. Treatment of normal mice with UDCA did not change the crypt length but resulted in a decrease of the number of proliferating cells per crypt and decrease in the expression of many pro- proliferative genes like Tcf4, Gbp2, Klf5, Irs-1, Il-15, Ghr and Flot2. UDCA treatment of colon cancer cells decreased proliferation and caused differential expression of genes identified in mice. The changes in gene expression in colon cancer cells were different from that observed in the mice. By contrast, proliferation of the nontransformed intestinal epithelial cell line IEC-6 was dose dependently inhibited by UDCA and the genes upregulated or downregulated in mice were similarly regulated in IEC-6 cell line. In IEC-6 cell line, Irs-1 mRNA and protein expression was strongly suppressed which decreased proliferation. UDCA treatment of IEC-6 cells caused high and persistent phosphorylation of ERK which was associated with an inhibition of EGF- or IGF-1-induced proliferation, a slow progress through the cell cycle, decreased uptake of BrdU, transcriptional suppression of Irs-1 and transcriptional upregulation of p21 mRNA and protein expression. Furthermore suppression of ERK1 but not of ERK2 or inhibition of phosphorylation of ERK1/ERK2 by pharmacological inhibitors, led to an increase in expression of Irs-1 and decrease in expression of p21. The inhibition of ERK-phosphorylation or suppression of ERK1 protein but not ERK2 protein abrogated the antiproliferative effects of UDCA. It was concluded that UDCA inhibits the proliferation of normal intestinal epithelial cells by causing high and persistent ERK phosphorylation wherein an ERK1-dependent transcriptional suppression of Irs-1 and upregulation of p21 contributes to the decrease of cell proliferation.

Zielsetzung: In den Vorarbeiten der AG Hanski wurde die Inhibition der kolitisbedingten Kolonkarzinogenese durch Gabe von Ursodesoxycholsäure (UDCA) im murinen Modell der DSS-Kolitis festgestellt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Wirkung von UDCA auf intestinale Zellen in vivo und in vitro zu untersuchen. Vorgehensweise: DSS-Kolitis-Mäuse sowie normale Mäuse wurden 3 Monate bzw. 3 Wochen mit einer Standarddiät mit oder ohne UDCA Supplementierung (0,4%) gefüttert. Die Kolonepithelzellen wurden isoliert, die Genexpression wurde einer Affymetrix-Array Analyse unterzogen. Die Validierung der Genexpressionsveränderungen erfolgte mit RT-PCR. Die Proliferation in vivo wurde durch den immunhistochemischen Nachweis des Ki-67 Proteins bzw. des eingebauten BrdUs verfolgt. Die in vivo detektierten potenziellen Mechanismen wurden anhand von humanen Kolonkarzinomzelllinien sowie einer nichttransformierten intestinalen Rattenzelllinie IEC-6 im Detail untersucht. Ergebnisse: Die anhaltende DSS-Kolitis bewirkte die Erhöhung der Anzahl der proliferierenden Zellen pro Krypte und eine Kryptenverlängerung. Die dreimonatige UDCA-Behandlung von DSS-Kolitis-Mäusen reduzierte die Anzahl der proliferierenden Zellen pro Krypte und die Kryptenlänge. Die dreiwöchige Behandlung der normalen Mäuse hatte ebenfalls eine Inhibition der epithelialen Proliferation jedoch ohne Kryptenverlängerung zur Folge. Mehrere Gene, wie Gbp2, Socs3, CcnK, die potenziell an Proliferation beteiligt sind, werden bei der Entzündung überexprimiert und durch die Behandlung mit UDCA auf ein niedrigeres Niveau gebracht. Im normalen Gewebe bewirkt die UDCA Behandlung ebenfalls die Suppression von potenziell an der Proliferation beteiligten Genen wie Tcf4, Gbp2, Klf5, Irs-1, Il-15, Ghr und Flot2. Die detaillierte Untersuchung der Rolle von zwei Genen, Gbp2 sowie TCF4 in humanen Kolonkarzinomzellen brachte jedoch keine schlüssigen Ergebnisse zu ihrer Beteiligung an der UDCA-vermittelten Proliferationsinhibition. Dies wurde u.a. darauf zurückgeführt, dass das Gesamtgenexpressionsprofil der humanen Kolonkarzinomzelllinien nach UDCA Behandlung von dem murinen Genexpressionsprofil unterschiedlich war. Demgegenüber entsprachen die UDCA- bedingten Genexpressionsveränderungen in der nichttransformierten intestinalen Rattenzelllinie IEC-6 den Veränderungen die im murinen Kolonepithel beobachtet wurden. Diese Zelllinie eignete sich somit sehr gut als Modell zur detaillierten Untersuchung der Wirkungsmechanismen der UDCA in vitro. UDCA inhibierte in der IEC-6 Zelllinie das proproliferative Signal von EGF sowie von IGF-1. Dies war mit einer starken und anhaltenden Phosphorylierung der ERK1/ERK2 Kinasen sowie mit der Suppression des Irs-1 Proteins verbunden, das an der Vermittlung des IGF-1 Signals beteiligt ist. Durch Anwendung von ERK Inhibitoren sowie durch die selektive Suppression von ERK1 bzw. ERK2 mittels siRNA konnte gezeigt werden, dass die antiproliferative Wirkung von UDCA durch ERK1 und nicht durch ERK2 vermittelt ist. Dauerhaft phosphoryliertes ERK potenziert die Transkription des p21WAF1/cip1 Proteins, das zur Proliferationsinhibition beiträgt. Darüber hinaus supprimiert die hochphosphorylierte ERK1 Kinase die Transkription des Irs-1 Proteins, wodurch das proproliferative IGF-1- Signal inhibiert wird. Schlussfolgerung: Zusammenfassend ist die durch UDCA Behandlung ausgelöste hohe und anhaltende ERK1 Phosphorylierung die entscheidende Veränderung, welche die transkriptionellen Alterationen von Regulatormolekülen (p21 Hochregulation, Irs-1 Suppression) auslöst und Zellzyklusverlangsamung sowie die Inhibition der EGF- und IGF-1-Signalwege zur Folge hat.