Development, characterization and imaging of bone metastasis mouse models -: The effect of Sagopilone on tumor growth and bone resorption

Abstract

Bone metastasis is an incurable disease considerably decreasing quality of life of patients with metastatic tumors of particularly breast, prostate, lung and kidney. The vicious cycle of bone metastasis is a multi step process in which tumor cells, osteoclasts, osteoblasts, the organic bone matrix and other factors are involved. Combination therapies that target different steps of the cycle could be especially effective in inhibiting growth of osteolytic bone metastases. However, current therapies are palliative and mostly target either tumor cells or osteoclasts. Thus, to develop therapy options and better understand the biology of breast and renal cell cancer (RCC) bone metastasis, it is crucial to develop new animal models. In this thesis, we have established a new experimental model of RCC bone metastasis by intracardiac (i.c.) inoculation of human 786-O/luciferase cells in athymic nude mice. The animals developed extensive osteolytic bone destruction as monitored by radiography and micro-CT scans within 10 weeks. The bone destruction observed was comparable to clinical settings and mainly occurred in hind limbs, forelimbs and the spine. To increase the bone-metastatic potential of the 786-O cell line and make the model suitable for evaluating compounds, an in vivo selection was done yielding a subclone causing osteolytic lesions in 7 weeks. To conclude, this model provides a reliable reproduction of the clinical situation and allows for designing effective treatments by better understanding the molecular mechanisms of RCC bone metastasis. In addition, the effect of sagopilone on tumor-induced osteolysis and tumor burden in athymic nude mice inoculated i.c. with MDA-MB-231(SA)/luciferase human breast cancer cells was examined. Imaging modalities (bioluminescent imaging, micro- CT, radiography) were evaluated for their use to monitor therapeutic effects in preclinical models of bone metastasis. Sagopilone, a novel, fully synthetic epothilone, inhibits the growth of breast cancer cells in vitro and in vivo. In this thesis its potency was determined in treatment models simulating the adjuvant (preventive) and metastatic (therapeutic) settings in the clinic. The study demonstrated that sagopilone significantly inhibited tumor burden and bone destruction compared with vehicle group and reduced tumor-induced cachexia and paraplegia. In the therapeutic model, sagopilone treatment significantly lowered the number of activated osteoclasts, and significantly reduced osteolytic lesion area, bone volume loss and bone resorption compared with vehicle treatment, while simultaneously inhibiting tumor burden. In this setting, sagopilone showed superior efficacy compared to paclitaxel. In vitro assays confirmed that sagopilone inhibited osteoclast differentiation and activation without cytotoxic effects and more efficiently than paclitaxel. Finally, the effect of sagopilone on osteoclasts was confirmed in vivo using a mouse model of ovariectomy (OVX)-induced osteoporosis. OVX mice treated with sagopilone showed higher trabecular bone density compared to OVX mice without treatment. Consequently, sagopilone appears to inhibit the vicious cycle of bone metastasis at both the tumor growth and bone resorption stages, suggesting the possibility for substantial benefit in the treatment of patients with breast cancer at risk from bone metastases or with bone lesions already present as well as possibly in other diseases with increased bone resorption.

Knochenmetastasen (KM) setzen die Lebensqualität von Patienten mit metastasierendem Brust-, Prostata, Lungen- und Nierenkrebs erheblich herab. Tumormetastasen im Knochen benötigen für ihr Wachstum Unterstützung von Osteoklasten, Osteoblasten und der Knochenmatrix. Kombinationstherapien sollten besonders effektiv sein, die Entstehung von osteolytischen KM zu hemmen. Derzeit zur Verfügung stehende Therapien sind palliativ und greifen entweder Tumorzellen oder Osteoklasten an. Tiermodelle, die diese Interaktionen in vivo modellieren, sind eine wichtige Voraussetzung, um die Entstehung von KM besser zu verstehen und neue Therapieansätze zu entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues experimentelles Nierenkrebs-KM- Modell durch Inokulation von humanen 786-O/luciferase Zellen in den linken Herzventrikel von athymischen Mäusen etabliert. Diese Tiere entwickeln innerhalb von 10 Wochen ausgeprägte osteolytische KM, wie mit Röntgen- und mikro-CT-Aufnahmen gezeigt wurde. Art und Ort der Osteolysen waren vergleichbar mit klinischen Befunden. Um die knochenmetastasierende Fähigkeit der 786-O Zellen zu erhöhen und das Modell zur Evaluation von Substanzen verwenden zu können, wurde eine in vivo Selektion durchgeführt, die in einer 7-wöchigen Ausbildung von KM resultierte. Dieses Modell kommt der klinischen Situation sehr nahe und erlaubt die Suche nach und Validierung von Behandlungen gegen durch Nierenkrebs verursachte KM. Um verschiedene Imagingtechniken (Biolumineszenz-Imaging, Mikro-CT, Röntgenaufnahmen) zum Nachweis von Therapieeffekten in präklinischen Modellen zu validieren, wurde der Effekt von Sagopilone auf tumorinduzierte Osteolyse und Tumorwachstum in athymischen Mäusen untersucht, die mit humanen Brustkrebszellen, MDA- MB-231(SA)/luciferase, intrakardial inokuliert wurden. Sagopilone, ein vollständig synthetisches Epothilon, inhibiert das Wachstum von Brustkrebszellen in vitro und in vivo. In den durchgeführten präklinischen Versuchen wurde die Wirksamkeit von Sagopilone in adjuvanten und therapeutischen Ansätzen entsprechenden Studien geprüft. Die Ergebnisse belegen, dass Sagopilone im präventiven Ansatz signifikant Tumorwachstum und Osteolyse im Vergleich zur Vehikelgruppe hemmt und tumorinduzierten Körpergewichtsverlust und Lähmungen reduziert. Im therapeutischen Modell senkte Sagopilone signifikant die Zahl an aktivierten Osteoklasten, reduzierte signifikant die osteolytische Läsionengröße, den Verlust an Knochenvolumen und -resorption als auch das Tumorvolumen im Vergleich zur Vehikel- und Paclitaxelbehandlung. In vitro assays bestätigten die stärkere Hemmung der Osteoklastenaktivierung und -differenzierung durch Sagopilone im Vergleich zu Paclitaxel, ohne zytotoxische Effekte auszuüben. Der Effekt von Sagopilone auf Osteoklasten wurde in vivo anhand eines Mausmodells für durch Ovarektomie (OVX)-induzierte Osteoporose bestätigt. OVX Mäuse, die mit Sagopilone behandelt wurden, zeigten höhere Knochendichten im Vergleich zu OVX Mäusen ohne Behandlung. Die Ergebnisse lassen die Schlussfolgerung zu, dass Sagopilone die Entstehung von KM über eine Wirkung sowohl auf Tumorzellen als auch auf Osteoklasten verhindert. Besonders Patienten mit Brustkrebs, die ein Risiko haben, KM zu bekommen als auch diejenigen, die schon an KM leiden, sowie möglicherweise auch Patienten mit erhöhter Knochenresorption könnten von einer Therapie mit Sagopilone profitieren.