dc.contributor.author
Wirths, Christopher Georg
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:11:53Z
dc.date.available
2006-11-12T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8984
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13183
dc.description
Titelblatt und Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Material
Methoden
Ergebnisse
Diskussion
Ausblick
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
Anhang
dc.description.abstract
In dieser Arbeit wurde das Histidin-Triaden-Protein Hint2 funktionell
charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass Hint2 als Homodimer vorliegt
und hauptsächlich in den Mitochondrien lokalisiert ist. Die Homodimerisierung
erfolgt durch die Interaktion der C-terminalen Aminosäuren des Proteins. Zudem
konnte gezeigt werden, dass Hint2 mit Hint1 und Hint3 heterodimere
Proteinkomplexe ausbilden kann. Die Heterodimerisierung wird ebenfalls durch
den C-Terminus von Hint2 vermittelt. Mit weiterführenden Untersuchungen
konnten das Hint3-Homodimer und die Heterodimerisierung von Hint3 mit Hint1
nachgewiesen werden. Immunfluoreszenz-Experimente zeigten, dass Hint3
hauptsächlich im Zytosol von HEK293-Zellen lokalisiert ist. Bisher ist jedoch
unklar, ob die Heterodimerisierungen unter physiologischen Bedingungen von
funktioneller Relevanz ist.
Enzymatische Analysen mit Hint2 zeigten, dass Hint2 AMA zu AMP hydrolisieren
kann. Die Hydrolaseaktivität wird durch Zn2+-Ionen im Vergleich zu Mg2+-Ionen
inhibiert. Als optimaler pH für die enzymatische Aktivität von Hint2 wurde pH
5,5 ermittelt. Eine Michaelis-Menten-Konstante (Km) von 28,3 µM und eine
katalytische Konstante (kcat) von 0,0067 s-1 wurde bei pH 5,5 bestimmt. Im
Rahmen der Charakterisierung von Hint2-Punktmutanten wurde herausgefunden,
dass die Hint2-H149N-Mutante zwar homodimere Komplexe ausbilden kann, aber
enzymatisch inaktiv ist. Hint2-Proteine mit einer S144A- oder einer H151N-
Mutation zeigten eine im Vergleich zum Wildtyp-Protein verringerte
Hydrolyseaktivität. Bei Messungen mit der Hint2-H147N-Mutante konnte
vergleichbar zur H149N-Mutante keine enzymatische Aktivität gemessen werden.
Als neuer Interaktionspartner von Hint2 konnte β-Catenin in in vitro-
Assoziations- und in Immunpräzipitationsexperimenten nachgewiesen werden. Bei
Reportergenanalysen wurde eine modulatorische Rolle von Hint2 auf die TCF-β
-Catenin-induzierte Transkriptionsaktivität festgestellt, jedoch zeigten sich
für unterschiedliche Promotoren entweder inhibierende oder aktivierende
Effekte.
de
dc.description.abstract
This work describes the functional characterization of the histidine triad
protein Hint2. Hint2 was shown to homodimerize via its C-terminal amino acids
and was localized predominantly in mitochondria. Furthermore, Hint2 forms
heterodimeric complexes with Hint1 and Hint3. These interactions are also
mediated by the C-Terminus of the Hint2-protein. Further experiments confirmed
that Hint3 is also able to form homodimeric complexes and, moreover, is able
to heterodimerize with Hint1. Immunofluorescence microscopy revealed that
Hint3 is mainly localized in the cytosol of HEK293 cells. In enzyme assays,
Hint2 was identified as an AMA hydrolase. Hint2 showed its highest enzymatic
activity at a pH of 5.5. Zinc ions where found to inhibit the hydrolysis of
AMA to AMP compared to magnesium ions. At a pH of 5.5, the Michaelis-Menten
constant (Km) for the hydrolysis of AMA was determined to 28.3 µM. The
catalytic constant (kcat) was 0.0067 s-1. Analysis of mutated Hint2 proteins
showed that the Hint2-H149N mutant was able to form homodimeric complexes, but
lost its enzymatic activity. The mutated proteins Hint2-S144A and Hint2-H151N
exhibited strongly reduced AMA hydrolase activity compared to the wild-type
protein. Mutation of the histidine 147 similar to the H149N mutant resulted in
the inability to hydrolyze AMA. Furthermore, β-catenin was identified as a new
interaction partner of Hint2 in in vitro pull-down assays and in
immunoprecipitation-experiments with endogenous proteins from cell lysates. In
reporter gene assays Hint2 was found to modulate the TCF-β-catenin-mediated
transcriptional activity. However, both activating and inhibting effects on
promoters of different genes were observed.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Histidin-Triade
dc.subject
Tumorsuppressor
dc.subject
Nukleotid-Hydrolase
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
dc.title
Funktionelle Charakterisierung des Histidin-Triaden (HIT)-Proteins Hint2
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Otmar Huber
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Roland Gust
dc.date.accepted
2006-11-20
dc.date.embargoEnd
2006-11-22
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002368-9
dc.title.translated
Functional characterization of the histidin triad (HIT)-protein Hint2
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000002368
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2006/591/
refubium.mycore.derivateId
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open access