dc.contributor.author
Fiddeke, Katharina
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:10:28Z
dc.date.available
2017-02-13T09:52:35.810Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8958
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13157
dc.description
DANKSAGUNG 3 INHALTSVERZEICHNIS 4 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 8 TABELLENVERZEICHNIS
10 1 EINLEITUNG 11 1.1 Das Influenzavirus – Aufbau und Replikation 11 1.2 Ein
Rückblick auf über 400 Jahre Influenza 14 1.3 Therapie und Vorbeugung einer
Influenza-Infektion: Die Geschichte von Hase und Igel 16 1.3.1 Antivirale
Therapie 16 1.3.2 Saisonale Influenza-Impfstoffe 17 1.3.3 Pandemische
Influenza-Impfstoffe 20 1.3.4 Breitenwirksame oder universelle Influenza-
Impfstoffe 25 1.4 Adenovirus-assoziierte Viren als Hoffnungsträger der
Gentherapie 29 1.4.1 Struktur und Replikation Adenovirus-assoziierter Viren 29
1.4.2 Etablierung von AAVs als virale Vektoren in der Gentherapie 30 1.4.3
AAV-basierte Influenza-Impfstoffe 33 1.5 Ziel der Arbeit 37 2 MATERIAL 38 2.1
Software 38 2.2 Enzyme 38 2.3 Kits 39 2.4 Oligonukleotide 39 2.5 Plasmide 40
2.6 Rekombinante Proteine und Peptide 41 2.7 Laborgeräte 41 2.8 Chemikalien 42
2.9 Puffer und Lösungen 45 2.10 Pro- und Eukaryotische Zellen und deren
Wachstumsmedien 47 2.11 Antikörper 48 2.12 Antibiotika 49 3 METHODEN 50 3.1
Zellkultur und Zell-basierte Methoden 50 3.1.1 Transfektion 50 3.1.2
Transduktion 50 3.1.3 Durchflusszytometrie 50 3.1.4 Zelllyse 51 3.1.5 IFN-γ
ELISpot 51 3.1.6 Bestimmung der Influenza-Viruslast in Lungen 52 3.2 DNA-
basierte Methoden 53 3.2.1 Transformation 53 3.2.2 DNA-Präparation 54 3.2.3
Restriktionsverdau 54 3.2.4 Agarose-Gelelektrophorese 54 3.2.5 Mutagenese 54
3.2.6 Klonierung 54 3.2.7 Sequenzierung 56 3.2.8 Quantitative Real-Time PCR 57
3.3 Protein-basierte Methoden 58 3.3.1 Herstellung rekombinanter Proteine 58
3.3.2 ELISA 58 3.3.3 SDS-PAGE 59 3.3.4 Westernblot 60 3.3.5 Immunfluoreszenz
60 3.3.6 Herstellung rekombinanter AAV Präparationen 61 3.4 Arbeiten mit
Tieren 64 3.4.1 Haltungsbedingungen 64 3.4.2 Immunisierungen 64 3.4.3
Blutentnahme und Gewinnung von Serum 65 3.4.4 Infektion mit Influenza
(Belastung) 65 3.4.5 Einzelzellpräparation der Lymphozyten der Maus 65 3.4.6
Injektion von Zellen 66 3.4.7 In vivo Imaging 67 3.4.8 Lungenentnahme 67 3.4.9
Histologie 68 4 ERGEBNISSE 72 4.1 Produktion und Kontrolle von AAV
Präparationen 72 4.1.1 Optimierung des Produktionsformats in Spinner Flaschen
und Quantifizierung hergestellter AAV Präparationen 72 4.1.2 Überprüfung der
Reinheit, Transfektionseffizienz in vitro und Stabilität gegenüber
Gefriertrocknung der AAVs 74 4.1.3 Untersuchung der Stabilität von
AAV9-Vektoren gegenüber Lyophilisieren 76 4.2 Überprüfung der AAV-vermittelten
Transgenexpression und Immunantwort in vivo 79 4.3 Homologe Schutzwirkung der
AAV-vermittelten Nukleoproteine von Influenza H1N1pdm09 und PR8 85 4.4
Heterologe Schutzwirkung des AAV-vermitteltes Influenza H1N1pdm09
Nukleoproteins 88 4.5 Einfluss des immunodominanten CD8+ T-Zell Epitops
NP366-374 auf heterologen Schutz 90 4.6 Untersuchung einer CD8+ T-Zell
Epitopkette relevanter Influenza-Subtypen bezüglich Immunogenität und
Schutzwirkung 93 4.7 Untersuchung der Funktionalität Zytotoxischer T-Zellen in
vivo 94 4.7.1 Etablierung des Tests zur Untersuchung der CTL Effizienz im
lebenden Tier 95 4.7.2 Mittels Epitopkette induzierte Zytotoxische T-Zellen
sind in vivo nicht funktionell 98 4.8 Reduktion der Viruslast nach Infektion
mit PR8 99 5 DISKUSSION 101 5.1 Von der Produktion zur Lagerung rekombinanter
AAV9 Vektoren 102 5.2 AAV9-basierte Immunisierung induziert Lang-anhaltende
Transgenexpression und Immunantwort in Bl/6-Mäusen 104 5.3 Homologer Schutz
nach AAV9-vermittelter Immunisierung mit Influenza Nukleoproteinen 106 5.4
Fehlender heterologer Schutz nach AAV9-vermittelter Immunisierung mit
Influenza NPpdm09 108 5.5 Immunodominantes Epitop NP366-374 trägt entscheidend
zu protektivem Effekt bei 110 5.6 Fehlender Schutz nach Immunisierung mit CD8+
T-Zell-Epitopkette 111 5.7 Zusammenfassende Darstellung 114 6 ZUSAMMENFASSUNG
117 LITERATUR 121 ANHANG 140 Vektorkarten 140 Abkürzungen 143
Unternehmensverzeichnis 149 EIGENSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 151
dc.description.abstract
Die permanente Entstehung von Driftvarianten des Influenzavirus reduziert die
Effektivität der derzeit angewandten Stamm-spezifischen Grippeschutzimpfung
und erschwert eine zeit- und kosteneffizienten Produktion. Zusätzlich bergen
zoonotische Influenza-Subtypen starkes pandemisches Risiko, was die
Entwicklung eines breitenwirksamen Impfstoffes forciert. Als Teil des von der
EU geförderten UNISEC-Projekts wurde innerhalb der vorliegenden Arbeit ein
vektorielles Impfstoffsystem untersucht, welches durch Immunisierung gegen das
hoch-konservierte Influenza Nukleoprotein (NP) mittels Adenovirus-assoziierten
Virus Serotyp 9 (AAV9) eine langanhaltende kreuzreaktive T-Zell-Antwort
induziert. Es konnte mittels in vivo Imaging im Mausmodell eine stabile
AAV9-basierte Transgenexpression sowohl nach intramuskulärer als auch nach
intranasaler Applikation über einen Zeitraum von 12 Monaten verfolgt werden.
Die Stärke der Transgen-spezifischen humoralen Immunantwort im Serum und der
Nachweis einer T-Zell-Reaktion 12 Monate nach Immunisierung wies die
Induzierbarkeit einer langanhaltenden Immunität nach. AAV-basierte
Immunisierung mit dem NP des pandemischen Virus Influenza A H1N1pdm09 und dem
NP der Maus-adaptierten Variante Influenza A H1N1 PR8 führte zu starken T Zell
Antworten im Mausmodell und schützte die Tiere nach homologer Belastung.
Obwohl Ergebnisse früherer Studien auf eine Kreuzreaktivität NP-spezifischer
T-Zellen hinweisen, konnte eine Immunisierung mit dem NP von H1N1pdm09 nicht
gegen eine heterologe Belastung mit PR8 schützen. Das immunodominante CD8+ T
-Zell-Epitop (NP366-374) wurde folglich durch Punktmutation an PR8 angepasst.
Dieses modifizierte Konstrukt vermittelte eine bislang noch nicht im
Belastungsversuch quantifizierte Impfeffektivität von 60 %. Basierend auf
diesen Ergebnissen war ein subtyp-übergreifender Schutz nach AAV basierter
Immunisierung mit einer synthetischen Kette aller immunrelevanten CD8+ T Zell
Epitope der verwendeten Mauslinie wahrscheinlich. Immunisierung mit diesem
Vektor schützte die Tiere im Belastungsversuch mit PR8 jedoch nicht. Dies
könnte auf eine fehlende Induktion weiterer Komponenten des Immunsystems als
den NP Epitop spezifischen CD8+ T-Zellen zurückgeführt werden. Erstmalig
konnte im Zuge der vorliegenden Arbeit ein System etabliert werden, das es
erlaubt die zytotoxische Aktivität spezifischer CD8+ T-Zellen im lebenden Tier
mittels in vivo Imaging zu verfolgen. Anhand des Assays konnte nachgewiesen
werden, dass nach AAV-basierter Immunisierung mit dem Volllängen-NP
spezifische T-Zellen unmittelbar Target-Zellen im Tier eliminieren konnten.
Dieser in vivo-Effekt konnte nach Immunisierung mit der Epitopkette jedoch
nicht nachgewiesen werden. Während im Rahmen der vorliegenden Arbeit
Schwachstellen eines NP-basierten monovalenten Impfstoffes aufzeigt werden
konnten, konnte gleichzeitig geschlussfolgert werden, dass eine starke NP-
spezifische Immunreaktion innerhalb einer multivalenten Immunisierung eine
wichtige Rolle zugeschrieben werden kann. AAV eignet sich aufgrund
vorteilhafter Charakteristika bezüglich Produktionseffizienz, Lagerung,
Sicherheit im Menschen sowie Dauer und Stärke der Transgen-spezifischen
Immunantwort ausgezeichnet für die Entwicklung einer Vektor-basierten,
breitenwirksamen Influenza-Vakzine.
de
dc.description.abstract
The permanently evolving drift variants of influenza virus often reduce the
effectiveness of commonly used strain specific flu vaccines and make it
difficult to produce vaccines in a time and cost effective manner. This, and
the near certainty of a zoonotic influenza infection leading to a new pandemic
in the future, drives efforts to develop broadly-protective vaccines. As part
of the EU-funded UNISEC project, this work investigated a vectored vaccine
system based on immunization against the highly conserved influenza
nucleoprotein (NP). The aim was to use adenovirus-associated virus serotype
9-mediated NP gene transfer to induce a long-lasting, cross-reactive T cell
response. Stable AAV9-mediated transgene expression over a period of 12 months
following intramuscular or intranasal administration in mice was demonstrated
by in vivo imaging. The levels of transgene-specific antibodies and T-cells
maintained during this time confirmed the induction of a sustained immune
response. Immunization of mice with AAVs expressing the NP of the pandemic
influenza A strain H1N1pdm09 and of the mouse-adapted laboratory strain A H1N1
PR8 resulted in strong T cell responses and after challenge with the
homologous influenza, all mice were protected. Although previous data had
indicated that NP-specific T cells were cross-reactive, immunization with the
NP of H1N1pdm09 was not able to protect against heterologous challenge with
PR8. The AAV-NP of H1N1pdm09 was therefore modified by point mutation to match
the immunodominant epitope (NP366-374) of PR8. This showed, for the first
time, that the epitope is protective for at least 60 % of the animals tested.
Based on these results, it seemed likely that AAV-mediated immunization using
a synthetic chain of all known NP CD8+ T cell epitopes for the mouse strain
would be broadly protective. However, mice immunized with such a vaccine
succumbed rapidly to challenge with PR8. This may be explained by the lack of
immune responses other than selected NP epitope-specific CD8+ T cells. The
work presented here included, for the first time, the establishment of a
system to track the cytotoxic activity of specific CD8+ T cells in living
animals using in vivo imaging. Using this assay it was possible to demonstrate
that, whereas T-cells induced by AAVs expressing the complete NP were able to
rapidly clear target cells from the body, no such in vivo effect was observed
after immunization with the NP epitope chain. This work demonstrates that
although NP-based monovalent vaccines have weaknesses that need to be
overcome, it nevertheless confirms that a strong NP-specific immune response
could play a critical role as part of a multivalent vaccine. The advantages of
AAV with regard to manufacturing efficiency, storage, safety in humans as well
as the duration and strength of transgene-specific immune response, make it an
excellent candidate for the further development of vectored broadly reactive
influenza vaccines.
en
dc.format.extent
151 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
broadly-protective Influenza vaccine
dc.subject
Adeno-associated virus
dc.subject
conserved antigens
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Evaluierung von Nukleoprotein-kodierenden AAV Vektoren als breitenwirksame
Influenza-Impfstoffe
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Norbert Bannert
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2017-01-20
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104137-4
dc.title.translated
Evaluation of AAV vectors encoding the Nucleoprotein as Broadly-Protective
Influenza Vaccines
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104137
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021041
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free
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open access