Trotz enormer medizinischer Bemühungen und geleisteter Forschungsarbeit bleiben kardiovaskuläre Erkrankungen die häufigste Todesursache weltweit. Insbesondere Myokardinfarkte führen aufgrund eines unausgeglichenen Verhältnisses von Herzmuskel-Schädigung und -Wiederherstellung zu Herzinsuffizienz. Mehrere Untersuchungen konnten zeigen, dass das postnatale Herz regeneratives Potenzial besitzt und kein terminal differenziertes Organ ist. Jedoch ist diese Regenerationsfähigkeit nicht ausreichend, um nach kardialem Stress den Verlust von kontraktiler Kraft auszugleichen und damit einer fortschreitenden Herzinsuffizienz entgegenzuwirken. Ein Verständnis der molekularen Mechanismen, welche die Remodellierung und den Verlust der Kontraktionsfähigkeit steuern, ist von essentieller Bedeutung zur Entwicklung neuer Therapien. Wie in der embryonalen Kardiogenese nimmt der Wnt/β-Catenin- Signaltransduktionsweg eine zentrale Rolle bei der Regulation von kardiovaskulären Progenitorzellen (CPCs) ein. Eigene Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe belegen, dass eine Inhibition dieser Signalkette bei Mäusen einen positiv-adaptiven Effekt auf die Herzremodellierung ausübt und zu gesteigerter Kardiomyozyten-Differenzierung von endogenen CPCs führt. Daher stellt eine Modulation des Wnt/β-Catenin-Signalweges einen vielversprechenden Ansatz dar. Da β-Catenin ubiquitär im Organismus vorliegt, wurde mittels Hefe-2-Hybrid Screening nach Herz-spezifischen Interaktionspartnern gesucht, welche die kardiale Differenzierung regulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zinkfinger-Transkriptionsfaktor Krüppel-like factor 15 (KLF15) als neuer kardialer Interaktionspartner von β-Catenin identifiziert. Mittels Ko- Immunpräzipitationen, Peptid-SPOT-Arrays und in vitro Mutationsstudien wurde ein Regulationskomplex aus KLF15, β-Catenin, dessen transkriptionellen Ko- Faktor T-cell factor 4 (TCF4) und dem nicht-kanonischen Wnt-Regulator Nemo- like Kinase (NLK) gefunden. β-Catenin/TCF-abhängige Luziferase-Genreporter- Studien zeigten einen konzentrationsabhängigen, inhibitorischen Effekt von KLF15 auf diese Transkriptionsaktivität. Mechanistisch wurde gezeigt, dass KLF15 zur vermehrten TCF4-Ubiquitinierung und damit subsequenten proteasomalen Abbau beiträgt. Untersuchungen der hierfür relevanten Protein- Interaktionsbereiche ergaben eine Notwendigkeit von mindestens zwei unterschiedlichen Proteinbindedomänen, die am N- und am C-Terminus von KLF15 lokalisiert werden konnten. Zusätzlich ist der C-Terminus als ausreichende und notwendige Region für die Zellkern-Lokalisation ermittelt worden. Funktionelle, histologische und molekulare Analysen einer systemischen Klf15 -Knockout-Maus (Klf15-KO) zeigten in vivo sowohl eine bisher unbekannte Fehlregulation des Wnt/β-Catenin-Signalweges spezifisch im Herzen als auch einen kardialen Phänotyp, welcher sich bereits basal als systolische Dysfunktion manifestierte. Diese trat progressiv im adulten Tier auf und erfolgte ohne klare Ausbildung einer kardialen Hypertrophie oder Fibrosierung. Bei hämodynamischer Belastung des kardiovaskulären Systems zeigte sich beim Klf15-KO im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine rapide Entwicklung von kardialer Remodellierung mit starker Dilatation der linken Herzkammer, Versteifung des Organs durch Fibrosierung, Verlust der Kontraktilität und hoher Mortalität. Detaillierte quantitative durchflusszytometrische und qrt-PCR Analysen der endogenen CPCs offenbarten eine gestörte Homöostase der Cell fate-Regulation in den Klf15-KO-Herzen, die mit verstärkter Proliferation von Endothelzell- Vorläufern auf Kosten der frühen Kardiomyozyten-Zell-Linie einherging. Die Etablierung eines in vitro Kultivierungssystems der CPCs aus adulten Mausherzen ermöglichte die Durchführung eines pharmakologischen Rescue- Experiments mit dem β-Catenin/TCF-Inhibitor Quercetin. Dieses erlaubte eine fast vollständige Wiederherstellung der normalen Cell fate-Homöostase der CPCs aus Klf15-KO-Herzen und belegte den klaren Zusammenhang zur dysregulierten Wnt/β-Catenin-Signalkaskade durch den funktionellen KLF15-Verlust. Die hier gezeigte Regulation der adulten Progenitorzell-Homöostase ergänzt die bereits bekannten und auch z.T. im humanen Herzen nachgewiesenen anti-hypertrophen und -fibrotischen Effekten von KLF15 und belegt damit die essentielle Rolle von KLF15 im adulten Herzen. Diese Erkenntnisse bieten ein neues Potenzial zur Entwicklung neuartiger Therapieansätze, welche nicht nur symptomatische, sondern kausale Behandlungen der Herzinsuffizienz verwirklichen könnten. Weitere detaillierte Untersuchungen dieser KLF15-Regulationsmechanismen werden helfen, um einen kardial-spezifischen Ansatz zu verfolgen.
Despite the enormous investigative effort, cardiovascular diseases and in particular myocardial infarction remains one of the major causes of heart failure due to imbalanced myocardial damage and repair. Several studies demonstrated a regenerative capacity of the adult mammalian heart arguing against the notion of it being a terminally differentiated organ. However, this regenerative ability is insufficient to stop loss of contractile function under stress conditions, leading to end-stage heart failure. The elucidation of the precise molecular mechanisms regulating cardiac remodelling and preventing loss of cardiac function is essential to develop novel therapeutical approaches. Similar to embryonic cardiogenesis, the Wnt/β-catenin signalling pathway was shown to play a central role in the regulation of progenitor cells of the adult heart (CPCs). Previous work of our group indicated that the downregulation of Wnt/β-catenin signalling is beneficial for adaptive cardiac remodelling and enhances differentiation of endogenous CPCs. Therefore, Wnt pathway-based therapeutic agents are highly attractive for the heart field. Since β-catenin is a ubiquitously expressed protein, a yeast-2-hybrid screen was performed to identify cardiac specific interaction partners of β-catenin with the ability to regulate differentiation of CPCs. In the present study the zinc finger transcription factor Krüppel- like factor 15 (KLF15) was found as a novel cardiac β-catenin interaction partner. Using co-immunoprecipitation, peptide-SPOT arrays and in vitro mutation studies a regulatory complex consisting of KLF15, β-catenin, its transcriptional co-factor T-cell factor 4 (TCF4), and the non-canonical Wnt regulator Nemo-like kinase (NLK) was identified. β-catenin/TCF-driven luciferase reporter assays showed a concentration-dependent repressive effect of KLF15 on β-catenin/TCF-mediated transcriptional activity. Mechanistically, KLF15 contributed to enhanced TCF4-ubiquitination and its subsequent proteasomal degradation. A detailed protein-protein interaction analysis revealed two distinct domains at the N- and C-terminus of KLF15 to be required for β-catenin/TCF inhibition. In addition, the C-terminus was found to be sufficient and necessary for nuclear localisation. Functional, histological and molecular analyses of a global Klf15-knockout mouse model (Klf15-KO) showed a so far unknown cardiac specific KLF15-dependent de-regulation of the Wnt/β-catenin signalling pathway in vivo as well as progressive systolic dysfunction in adulthood. This dysfunction was not accompanied by cardiac hypertrophy and/or fibrosis at baseline. Under induced hemodynamic stress significant loss of contractile function accompanied with accelerated left ventricular dilation and increased fibrosis resulted in high mortality in Klf15-KO vs. wild-type mice. Analyses of the endogenous CPCs by quantitative flow cytometry and qrt-PCR showed increased proliferation of endothelial progenitors at the expense of the cardiomyogenic lineage indicating an imbalanced cell fate regulation in the Klf15-KO hearts. The setup of an in vitro culture system for adult CPCs enabled a pharmacological rescue experiment using the β-catenin/TCF inhibitor Quercetin. This resulted in an almost complete restoration of the Klf15-KO-CPC cell fate to wild-type CPC levels substantiating that de-repression of Wnt/β-catenin signalling, upon KLF15 loss, is responsible for the altered CPC homeostasis in Klf15-KO mice. The presented work demonstrates the major impact of KLF15 on adult heart biology at least in part by controlling CPC homeostasis. These observations complement previous studies showing the anti-hypertrophic and anti-fibrotic effects of KLF15, also shown in the human heart. This knowledge opens a new avenue for the development of novel causal therapies of heart failure. Further in-depth elucidations of the KLF15 regulatory mechanisms will reinforce cardiac specific therapeutical approaches.
