Cloning of IFNγ and IL-4 in zoo animals and an approach to determine expression levels of these cytokines by real-time PCR

Abstract

The detection of cytokines provides valuable information about the nature of the host response to infections. At the present study, a sequence-based species-specific real-time RT-PCR was established to measure equine mRNA expression levels of IFN and IL-4 as key cytokines, involved in Th1/Th2 immune regulations. To have the opportunity to expand this test to wildlife species, cloning of IFN and IL-4 cDNA from PBMC of different zoo species such as Somali wild ass (Equus africanus somalicus), Grevy s zebra (Equus grevyi), Hartmann s mountain zebra (Equus zebra hartmannae), Indian one-horned rhinoceros (Rhinoceros unicornis), Asian elephant (Elephas maximus), European bison (Bison bonasus), African buffalo (Syncerus caffer) and Nubian giraffe (Giraffa camelopardalis) was performed. While IFN sequences revealed a significant conservation of 72-79% between humans and analysed species, IL-4 showed a higher degree of divergence (only 62-64% homology). For horse as a model animal, species-specific primers and probes were designed to establish a real-time RT-PCR. The limits of detection were found to be as low as one molecule of DNA using IFN or IL-4 plasmids. Sample-to-sample variation in the efficiency of the RT, as well as in the quantity and quality of the starting RNA, was normalized to the endogenous housekeeping gene 18S rRNA. The assay was applied to monitor the kinetics of IFN and IL-4 mRNA expression in vitro after mitogenic or anti-equine CD3 mAb stimulation, supported by anti-CD28 co- stimulation. Thereafter, recall antigens typical for horse vaccination, Equine herpesvirus-1 (EHV-1) and tetanus toxoid (TT), were applied in vitro. Cytokine mRNA kinetics of the mitogen-stimulated PBMC demonstrated a rapid and stable increase in IFN mRNA expression, and a rapid but transient increase in IL-4 mRNA expression. EHV-1 and TT stimulation resulted in a peak mRNA expression for both cytokines within 12 hours of activation. The high sensitivity and specificity of such real-time quantitative PCR assays could make them a valuable tool to study immunologic responses and cytokine profiles of zoo and wildlife species in the future allowing the analysis of even large numbers of samples over a broad detection range.

Die Bestimmung von Zytokinen bietet wertvolle Informationen über die Eigenschaften der Immunantwort des Wirtes gegen Infektionen. In dieser Arbeit wurde eine spezies-spezifische real-time PCR etabliert um die mRNA Expression von equinem IFN und IL-4 zu bestimmen, die als Schlüsselzytokine an der Th1 und Th2 Immunregulation beteiligt sind. Um die Möglichkeit zu haben, diese Analyse auf Wildtiere zu erweitern, wurden die cDNAs von IFNγ und IL-4 aus PBMC von unterschiedlichen Zootier-Spezies wie z.B. von Somali Wild Esel (Equus africanus somalicus), Grevy Zebra (Equus grevyi), Hartmann Zebra (Equus zebra hartmannae), Indian Ein-Horn Nashorn (Rhinoceros unicornis), Asiatischer Elefant (Elephas maximus), Europäisches Bison (Bison bonasus), Afrikanischer Büffel (Syncerus caffer) und Nubische Giraffe (Giraffa camelopardalis) kloniert. Die IFNγ Sequenzen zeigten eine deutliche Konservierung (72-79%) zwischen der humanen Sequenz und den untersuchten Spezies, während IL-4 eine höhere Diskrepanz (nur 62-64% Homologie) zwischen humaner Sequenz und den untersuchten Spezis aufwies. Für Pferde, als Modell, wurden spezies- spezifische Primer und Sonden entwickelt, um eine real-time RT-PCR zu etablieren. Mittels IFNγ oder IL-4 Plasmiden wurde ermittelt, dass die Nachweisgrenze nahe einem DNA Molekül lag. Unterschiede zwischen den Proben bezüglich des Wirkungsgrades der RT, als auch in der Quantität und Qualität der RNA wurden mit der endogenen 18S rRNA abgeglichen. Der Assay wurde angewandt, um die Kinetik der IFNγ und IL-4 mRNA Expression nach Mitogen oder Anti-equine CD3 Aktivierung in vitro, unterstützt durch anti-CD28 co- stimulation, zu bestimmen. Danach wurden Antigene die typischerweise zur Impfung eingesetzt werden, wie das equinem Herpesvirus-1 (EHV-1) und Tetanus Toxoid (TT) zur Wiederholungs-Aktivierung in vitro angewandt. Die Kinetik der Mitogen-stimulierten PBMC zeigte einen schnellen und stabilen Anstieg der IFNγ mRNA Expression und einen schnellen aber vorübergehenden Anstieg der IL-4 mRNA Expression. Die EHV-1 und TT Stimulation führte zu einer mRNA Expressions- Spitze beider Zytokine innerhalb von 12 Stunden nach Aktivierung. Die hohe Sensitivität und Spezifität solcher real-time PCRs könnte diese zu einem wertvollen Werkzeug bei der Studie von immunologischen Antworten und der Erstellung von Zytokinprofilen bei Zoo- und Wildtierspezies machen, welches in Zukunft die Möglichkeit bietet, auch eine große Anzahl von Proben über ein breites Nachweis-Spektrum zu analysieren.