Erythrozyten als Drug-Carrier für eine Krebstherapie: in vitro Untersuchungen am Kolonkarzinom-Modell

Abstract

Während für die Therapie örtlich begrenzter Primärtumoren operative und strahlentherapeutische Behandlungskonzepte zur Verfügung stehen, basiert die therapeutische Versorgung der meisten metastasierten Krebserkrankungen auf einer systemischen Chemotherapie mittels Zytostatika. Hierbei kommt es zu einer unselektiven Hemmung des Zellwachstums, bevorzugt der entarteten Zellen, da diese höhere Teilungsraten als gesunde Körperzellen aufweisen. Um wirksame Konzentrationen an Zytostatika innerhalb der Metastasen zu erreichen, muss bisher auch das gesunde Gewebe entsprechend hohen Wirkstoffspiegeln ausgesetzt werden. Dadurch können therapielimitierende Nebenwirkungen auftreten. Ein vielversprechender Lösungsansatz ist der zielgerichtete Transport von Medikamenten mit Hilfe von Carrier-Molekülen zu den Tumorherden unter Umgehung des nicht entarteten Gewebes. Erythrozyten weisen besonders viele günstige Eigenschaften für die Verwendung als Drug-Carrier auf. Sie zeichnen sich durch eine sehr hohe Biokompatibilität, lange Überlebenszeit und eine hohe Beladungskapazität aus. In Abhängigkeit von der Beladungsprozedur und der Oberflächenmodifikation ist es möglich, Carrier-Erythrozyten unter anderem als Langzeit-Arzneimittelreservoir für ein gezieltes RES-, Milz- oder Lebertargeting zu verwenden. Das kolorektale Karzinom (CRC) stellt eines der häufigsten Karzinome dar und tritt bei etwa 6% der Gesamtbevölkerung auf. Die adjuvante, neoadjuvante und palliative Therapie kolorektaler Karzinome basiert auf der Durchführung eines 5-FU-Folinsäure-haltigen Therapieprotokolles. Ziel dieser Arbeit war es, das Zytostatikum 5-FU mittels Carrier-Erythrozyten für den zielgerichteten Medikamententransport zu Lebermetastasen des CRC einer optimierten Chemotherapie zugänglich zu machen. Aufgrund der Membrangängigkeit von 5-FU mussten geeignete Modifikationen an 5-FU vorgenommen werden, um die Passage durch die Erythrozytenmembran zu verhindern, jedoch ohne dessen Zytotoxizität wesentlich zu beeinflussen. Deshalb wurde 5-FU in die kopplungfähigere Fluorouracil-Essigsäure (FUAC) umgewandelt und an die unschädlichen, biologisch abbaubaren Makromoleküle Dextran und EPS 4-Nanopartikel gekoppelt. Diese eignen sich für die Beladung der Erythrozyten, verbessern darüber hinaus die pharmakodynamischen Eigenschaften des gekoppelten Wirkstoffes und führen zu einer Reduktion der Toxizität. Die zytostatischen Eigenschaften der FUAC-Makromoleküle auf Kolonkarzinomzellen sollten in vitro untersucht werden. Außerdem wurden die Erythrozyten mit den Modellsubstanzen FITC-Dextran und FITC-Albumin beladen, um die optimalen Beladungsbedingungen für einen größtmöglichen Beladungserfolg unter Schonung der Erythrozytenmorphologie festzulegen. Das Gelingen der Umwandlung von 5-FU zu FUAC wurde anhand der UV/VIS-Spektren beider Substanzen belegt. Der Nachweis über eine erfolgreiche Kopplung von FUAC an die Makromoleküle erfolgte mittels NMR-Spektroskopie und Partikelelektrophorese. Eine gelungene Erythrozytenbeladung mit FITC-Albumin und -Dextran wurde mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Laserscanningmikroskopie nachgewiesen. In vitro konnte gezeigt werden, dass die antiproliferative Wirkung der FUAC- Makromolekülkonjugate im Vergleich zu dem freien Wirkstoff innerhalb des Versuchs-zeitraumes herabgesetzt ist. Ursache hierfür ist die angestrebte verzögerte Freisetzung des Wirkstoffes aus der Verbindung mit Dextran und Nanopartikeln über vermutlich zwei bis drei Wochen. Daraus resultiert eine später einsetzende, sich mit der Zeit der Wirksamkeit des freien 5-FU annähernden Wirkung. Diese vorteilhafte Eigenschaft der verzögerten Freisetzung in Verbindung mit der Beladung von Carrier-Erythrozyten mit Wirkstoff-Makromolekülkonjugaten statt freien Wirkstoffen eröffnet eine vielversprechende neue Strategie der Chemotherapie. Denkbar für die Zukunft ist zum einen der Einsatz freier FUAC-Konjugate. Dadurch soll eine langsame Freisetzung des Wirkstoffes innerhalb der Leber erreicht und durch den EPR- Effekt eine Akkumulation im Tumorgewebe bewirkt werden. Zum anderen ist die Verwendung von mit FUAC-Konjugat beladenen Erythrozyten mit möglichst physiologischer Morphologie als Langzeit-Zytostatikareservoir vielversprechend. Dabei würden die durch den Erythrozytenabbau langsam freigesetzten Konjugate in der Leber akkumulieren und die zytostatische Wirkung von 5-FU nach Aufnahme in die Krebszelle bzw. nach Freisetzung aus den hepatischen Makrophagen lokal entfaltet. Um das Lebergewebe zu schonen, ist eine zusätzliche krebszellspezifische Modifikation sowohl der Nanopartikel als auch der Erythrozyten denkbar und vielversprechend.

While for the treatment of primary local tumors there are surgical as well as radiational therapies available, the patient-centered care for most metastatic cancer diseases is based upon chemotherapy with antineoplastic drugs. Here cell growth is non-selectively inhibited, but malignant cells that divide more rapidly than healthy cells are targeted. In order to reach effective concentrations of antineoplastic substances inside the metastases, high concentrations of drugs have to be applied to all tissues. As a consequence side-effects may occur, that limit the therapy. Targeted transport of the drug to the tumor-bearing location using carrier-molecules is one of the most promising approaches to solving this problem. Carrier-erythrocytes have remarkable biocompatibility, biodegradability, and life-span in circulation and are thus an excellent delivery system. Application of erythrocytes as containers for drugs minimizes toxicity, decreasing the risk of side effects and pathologic immune reactions against encapsulated agents while improving their efficacy. This permits the modification of their pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, thus allowing for reduction of single and course doses and longer treatment intervals, which leads to better patient compliance. Depending on surface-modification and the loading procedure, erythrocytes can be used as a longtime drug-reservoir or for directed RES- and liver targeting. Colorectal cancer (CRC) is one of the most common cancers, affecting 6% of the population. The neoadjuvant, adjuvant as well as the palliative chemotherapy of CRC is based on therapy regimes containing 5-fluoroucil (5-FU) and folic acid. The aim of this research was to optimize chemotherapy through targeted delivery of 5-FU to hepatic metastases of CRC via carrier-erythrocytes. 5-FU is a very small and hydrophobic molecule which can pass through the erythrocytic membrane. Therefore the drug was modified and converted into fluorouracil-acetic-acid (FUAC) with a carboxy group in order to be connected to biocompartible and harmless marcomolecules of dextran and nanoparticles, which are suitable for loading carrier-erythrocytes, improve the pharmacodynamic properties, and reduce toxicity of the coupled agent. The antineoplatic effect of the FUAC-conjugates (FUAC-dextran, FUAC- nanoparticles) was analysed in vitro in coloncarcinoma cell culture. Furthermore erythrocytes were loaded with model substances (FITC-dextran, FITC-albumin) to characterize the ideal loading procedure with high loading efficiancy and morphologically unchanged erythrocytes. The proof of a successful conversion of 5-FU to FUAC was provided by photometry and NMR spectroscopy. The detection of coupling FUAC to the macromolecules was done spectroscopically with NMR and with particle electrophoresis. Loading erythrocytes with model substances was detected and quantified by FACS (fluorescence activated cell sorting) and CLSM (confocal laser scanning microscopy). In vitro analysis showed a lower antiproliferative effect of FUAC-conjugates compared to the free 5-FU and FUAC, which is based on the requested delayed release presumably over a period of two or three weeks. The benefit of delayed drug release combined with loading carrier-erythrocytes opens a new strategy of chemotherapy. For the future it is supposable to apply free FUAC-conjugates which accumulate through EPR-effect inside malignant tissue and release 5-FU in liver and metastases. Furthermore FUAC-conjugates loaded carrier-erythrocytes are promising as a long term drug-reservoir. Here 5-FU would be released through erythrocyte depletion in hepatic macrophages slowly and constantly. The anti-proliferative effect would attack the metastases as well as the hepatocytes. For protection of liver tissue a cancer cell specific modification of nanoparticles or erythrocytes shows promise.