Endothelin-1 (ET-1) is a potent vasoactive peptide that acts on endothelin A
(ETA) and endothelin B (ETB) receptors. Although both receptor subtypes are
co-expressed in numerous cells, little is known about their ability to form
heterodimers. In this study it was shown that both receptors were coimmunoprecipitated
with an ETB-specific antibody using extracts from HEK293
cells stably co-expressing a fusion protein consisting of a myc-tagged ETA
receptor and CFP (ETAmyc.CFP) and a fusion protein consisting of an ETB
receptor and YFP (ETB.YFP). Co-immunoprecipitation was also observed with
extracts from HEK293 cells transiently co-expressing FLAG-tagged ETB and
myc-tagged ETA receptors, thereby excluding that heterodimerisation is
mediated by the CFP/YFP moieties. Heterodimerisation was further confirmed
in fluorescence resonance energy transfer (FRET) analysis of HEK293 cells
transiently co-expressing ETAmyc.CFP and ETB.YFP receptors. Additionally
homodimerisation of ETA and ETB receptors could be demonstrated in FRET
analysis of HEK293 cells transiently co-expressing ETAmyc.CFP and
ETAmyc.YFP or ETB.CFP and ETB.YFP receptors. FRET efficiencies were
between 12 and 18% in untreated and antagonist- or ET-1-treated cells,
indicating constitutive homo- and heterodimerisation. Prolonged stimulation
(30 min) with the ETB receptor-selective agonist BQ3020 decreased FRET
efficiency by 50%. This decrease was not observed when internalisation was
inhibited by co-expression of dominant-negative K44A.dynamin I or incubation
with 450 mM sucrose. Enzyme-linked immunosorbent assay and laser scanning
microscopy of cell clones stably co-expressing ETAmyc.CFP/ETBflag.YFP
receptors revealed a slower sequestration of the ETB.flag.YFP receptors upon
stimulation with ET-1 than with BQ3020. No difference in ET-1 or BQ3020-
mediated sequestration was observed with cell clones expressing ETBflag.YFP
alone. The data suggest that ETA and ETB receptors form constitutive
heterodimers, which show a slower sequestration upon stimulation with ET-1
than with BQ3020. Heterodimer dissociation along the endocytic pathway only
occurs upon ETB receptor- selective stimulation.
Endothelin-1 (ET-1) ist ein potentes vasoaktives Peptid dessen Wirkung über
den Endothelin-A- (ETA) und den Endothelin-B-Rezeptor (ETB) vermittelt wird.
Obwohl beide Rezeptoren in zahlreichen Zelltypen koexpremiert werden, ist
nur wenig darüber bekannt ob diese Heterodimere bilden können. Mittels eines
ETB-Rezeptor-spezifischen Antikörpers wurde in dieser Arbeit eine
Kopräzipitation beider Rezeptorsubtypen aus HEK293 Zellextrakten
nachgewiesen, welche den ETA\- als myc- und CFP-Fusionsprotein und den ETBRezeptor
als YFP-Fusionsprotein stabil koexpremieren. Eine Kopräzipitation
konnte ebenfalls aus Extrakten von HEK293 Zellen nachgewiesen werden, die
transient den ETA-Rezeptor als myc- und den ETB-Rezeptor als FLAG-Epitop
markierte Rezeptoren exprimieren. Hierbei wurde ausgeschlossen, dass die
Heterodimerisierung über eine Aggregation der CFP- und YFP-Fusionsproteine
vermittet wurde. Die Heterodimerisierung wurde weiterhin durch Fluoreszens-
Resonanz-Energie-Transfer (FRET) Analysen bestätigt, die an HEK293 Zellen
durchgeführt wurden, welche transient ETAmyc.CFP- und ETB.YFP-Rezeptoren
koexpremieren. Zusätzlich konnte eine Homodimerisierung der ETA-und ETBRezeptoren
in HEK293 Zellen nachgewiesen werden, welche transient
ETAmyc.CFP- und ETAmyc.YFP- oder ETB.CFP- und ETB.YFP-Rezeptoren
koexpremieren. Es wurden FRET Effizienzen zwischen 12% und 18% in
unbehandelten, Agonist- oder ET-1-behandelten Zellen gemessen, was eine
konstitutive Homo- und Heterodimerisierung nahelegt. Eine verlängerte
Stimulation (30 Min.) der Zellen mit einem ETB-spezifischen Agonisten
(BQ3020) führte zu einer Verminderung der FRET Effizienz um 50%. Diese
Reduzierung konnte nicht gemessen werden, wenn die Internalisierung durch
eine Koexpression von dominant-negativem K44A-Dynamin I oder durch die
Zugabe von 450 mM Saccharose inhibiert wurde. ELISA (enzyme-linked
immunosorbent assay) und LSM (laser scanning microscopy) Analysen wiesen
in Zellklonen, welche stabil ETAmyc.CFP- und ETBflag.YFP-Rezeptoren
koexpremieren, eine verlangsamte ET-1-vermittelte Internalisierung des
ETBflag.YFP- Rezeptors nach. Jedoch konnten keine Unterschiede in der ET-1-
oder BQ3020-vermittelten Internalisierung an Zellklonen beobachtet werden,
die den ETB.flag.YFP-Rezeptor alleine expremieren. Die vorliegenden Daten
zeigen, dass ETA\- und ETB-Rezeptoren konstitutive Heterodimere bilden, deren
Sequestrierung nach ET-1 Stimulation im Vergleich zu einer Stimulierung mit
BQ3020 verlangsamt ist. Die Dissoziation des Heterodimers während der
Internalisierung und des intrazellulären Transports erfolgt nur nach ETBRezeptor-
selektiver Stimulation.
