Immun-Escape Mechanismen bei Tumoren und ihre Bedeutung für Prognose und Entwicklung immuntherapeutischer Therapieansätze

Abstract

Ein wesentliches Kennzeichen von Tumoren ist, dass sie sich der Zerstörung durch das Immunsystem entziehen können. Immun-Escape-Mechanismen, die sowohl Antigenität, Immunogenität als auch Immunregulation betreffen, können nicht nur Einfluss auf die Prognose einer Tumorerkrankung haben, sondern müssen - neben der Wahl des Antigens - auch bei der Entwicklung immuntherapeutischer Strategien berücksichtigt werden. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Eignung des embryonalen Transkriptionsfaktors Wilms-Tumor-Protein 1 (WT1) im Allgemeinen und dem WT1126-134-Epitop im Speziellen als therapeutisches T-Zell-Target sowie mit potentiellen Immun-Escape-Mechanismen, die zum Verlust von Antigenität und somit zum Versagen T Zell-therapeutischer Strategien führen. Wir konnten zeigen, dass sich WT1 nicht nur als Target für die AML eignet, sondern auch als Target für alle Subtypen der ALL, mit Ausnahme der reifen B-ALL. Die reife B-ALL zeigte einen nur sehr niedrigen Expressionslevel, der unterhalb des Expressionslevels von gesunden hämatopoetischen Stammzellen lag. Neben der Wahl des Antigens müssen bei der Entwicklung T-Zell-therapeutischer Strategien eine Vielzahl von Mechanismen bedacht werden, die zu Verlust von Antigenität und somit zu fehlender T-Zell- Erkennung bzw. Ignoranz führen. Dies kann nicht nur durch Verlust der Antigenexpression bedingt sein, sondern auch durch Mutationen im Bereich von spezifischen T-Zell-Epitopen oder Epitop-flankierenden Sequenzen. Diese Mechanismen scheinen jedoch bei AML-Patienten, die unter Tumorimpfung mit dem WT1126-134-Peptid im Rahmen einer von der Arbeitsgruppe initiierten klinischen Studie trotz nachgewiesener Induktion einer WT1126-134-spezifischen T-Zell- Antwort einen Progress erlitten, keine Rolle zu spielen. Ferner konnte auch ein genereller Prozessierungsdefekt von HLA-I-assoziierten Epitopen ausgeschlossen werden; die Prozessierung des WT1126-134-Epitopes im Speziellen wurde allerdings in dieser Arbeit nicht untersucht. Unklar ist zurzeit, ob dieses Epitop überhaupt effizient von allen Tumorzellen prozessiert werden kann und welche Proteasen hieran beteiligt sind. Auch eine nicht passende Komposition der Proteasom-Typen in den entsprechenden Tumorzellen kann zu fehlender Präsentation und damit zu Immun-Escape führen. Wir konnten zeigen, dass neoplastische lymphatische Zellen Standardproteasom- und Immunoproteasom- Untereinheiten in zusammengelagerten Proteasomen exprimieren. Eigene bisher nicht veröffentlichte Analysen mittels quantitativem ELISA zeigten, dass Blasten von Patienten mit AML und hoher Tumorlast zu >90% Immunoproteasomen und keine Standardproteasomen exprimieren, am ehesten bedingt durch den Einfluss der inflammatorischen Tumorumgebung. Für therapeutische Ansätze mit breiter klinischer Anwendung sind daher Epitope, die nur von einem Proteasom- Typ prozessiert werden, unter Umständen nicht geeignet. Mikrometastasen und sogenannte Tumorstammzellen (cancer stem cells, CSCs) werden möglicherweise nicht von T-Zell-therapeutischen Ansätzen erreicht. Tumorsphären, die als in- vitro-Modell für mit CSCs angereicherte Mikrometastasen dienten, zeigten eine Herunterregulation oder sogar Verlust von HLA-Molekülen, am ehesten durch epigenetische Regulation auf postranskriptionellem Level. Weitere Untersuchungen hierzu sind sinnvoll, um zu klären, ob die HLA-Expression mittels Medikamente, die in die epigenetische Regulation eingreifen, wie DNA- Methyltransferase-Hemmstoffe oder Histon-Deacetylase-Inhibitoren, wiederhergestellt werden kann. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die durch den Tumor induzierte periphere Immundysregulation, ihre prognostische Bedeutung und mögliche Modulation durch tumorspezifische Therapie bei Patienten mit lokal fortgeschrittenem Melanom und bei Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (mRCC) näher untersucht. Immundysregulation ist mit zunehmendem Tumorwachstum nicht nur in der unmittelbaren Tumorumgebung und den regionalen Lymphknoten nachweisbar, sondern auch systemisch im peripheren Blut (pB) - auch schon bei lokal fortgeschrittenen Tumoren, wie in dieser Arbeit z. B. für das Maligne Melanom gezeigt. Melanompatienten im Stadium III, die adjuvant mit PEG-IFNα-2b im Rahmen der EORTC 18991 Studie behandelt wurden, wiesen signifikant höhere TGFβ1-mRNA Expressionslevel im pB im Vergleich zu Gesundkontrollen auf, interessanterweise jedoch ohne signifikante Assoziation mit klinischen oder pathologischen Eigenschaften und ohne prognostische Bedeutung. Jedoch konnten höhere mRNA-Expressionslevel von SOCS1 und SOCS3, Inhibitoren des JAK/STAT Signalweges, als prognostisch ungünstige Marker sowohl für das rezidivfreie Überleben als auch das fernmetastasenfreie Überleben identifiziert werden. Weitere Arbeiten untersuchten die periphere Immundysregulation und ihre prognostische Bedeutung bei mRCC Patienten, die den Tyrosinkinaseinhibitor Sorafenib im Rahmen eines „expanded access“ - Programms erhielten. Zunächst lag der Fokus auf immunsuppressiven Zytokinen und Zellpopulationen. Im Vergleich zu einer gesunden Kontrollpopulation wurden bei den mRCC-Patienten signifikant erhöhte mRNA-Expressionslevel von den immunsuppressiven Zytokinen TGFβ1 und IL10 als auch erhöhte Frequenzen von CD4+CD25highFoxP3+-T-Zellen, die am ehesten immunsuppressiven regulatorischen T-Zellen entsprechen dürften, nachgewiesen. In einer multivariaten Analyse wurde neben einem niedrigen ECOG Performance Status Score überraschenderweise eine hohe mRNA-Expression von TGFβ1 als unabhängiger günstiger prognostischer Faktor für das progressionsfreie Überleben (PFS) als auch für das Gesamtüberleben (OS) identifiziert. Neben immunsuppressiven Faktoren können auch Veränderungen in der Frequenz und Funktion von Immun-Effektorzellen der adaptiven und angeborenen Immunantwort eine Rolle in der Tumor-induzierten Immundysbalance spielen. In einer weiteren Untersuchung wurde die mRNA- Expression des T-box-Transkriptionsfaktors Eomes im pB, die mit der Expression von TGFβ1 im pB korrelierte, als unabhängiger günstiger prognostischer Faktor für das PFS und OS von mit Sorafenib behandelten mRCC-Patienten identifiziert. Ob eine höhere mRNA-Expression von Eomes oder TGFβ1 als Indikator für eine günstige Immunsignatur bei mRCC-Patienten unter zielgerichteter Therapie ein brauchbarer Marker ist, sei es allein oder in Kombination mit schon etablierten klinisch-pathologischen Eigenschaften oder zirkulierenden angiogenen Markern wie VEGF oder Zytokinen, muss noch an einer größeren Patientenkohorte in einer prospektiven Studie evaluiert werden. In-vitro-Daten haben gezeigt, dass TKIs wie Sorafenib nicht nur die spezifischen Signalwege in den Tumorzellen beeinflussen, sondern auch die entsprechenden Signalwege in Immuneffektorzellen. An einer Kohorte von 35 mRCC-Patienten wurde der Effekt von Sorafenib in vivo untersucht. Sorafenib hatte keinen negativen Effekt auf die Typ I-T-Zell-Antwort, war aber nicht in der Lage den oben beschriebenen immunsuppressiven Phänotyp im pB von mRCC-Patienten zu beheben. Sorafenib ist somit ein möglicher, jedoch kein optimaler Kandidat für immuntherapeutische Kombinationsstrategien.

An essential characteristic of tumors is that they can escape the destruction by the immune system. Immune escape mechanisms that affect both antigenicity, immunogenicity and immune regulation can not only influence the prognosis of a tumor disease, but must also be taken into consideration, in addition to the choice of the antigen, in the development of immunotherapeutic strategies. The first part of this study was concerned with the suitability of the embryonic transcription factor Wilms tumor protein 1 (WT1) in general and the WT1126-134 epitope in particular as a therapeutic T cell target as well as with potential immune escape mechanisms, which lead to loss of antigenicity and thus to failure of T cell-based therapeutic strategies. We were able to show that WT1 is suitable as a target not only for AML, but also for all subtypes of adult ALL, except mature B-ALL. Mature B-ALL showed a very low expression level of WT1 below the expression level of healthy hematopoietic stem cells. In addition to the choice of the antigen, a large number of mechanisms have to be considered in the development of T cell-based therapeutic strategies, leading to loss of antigenicity and thus to the lack of T cell recognition or ignorance. This can be caused not only by loss of antigen expression, but also by mutations in the region of specific T cell epitopes or epitope flanking sequences. However, these mechanisms do not appear to play a role in AML patients who received vaccination with the WT1126-134 peptide within a clinical trial initiated by our own group, and progressed despite induction of a WT1126-134 specific T cell response. Furthermore, a general processing defect of HLA-I associated epitopes could also be excluded; however, the processing of the WT1126-134 epitope in particular was not investigated in this work. It is currently unclear whether this epitope can be processed efficiently by all tumor cells at all and which proteases are involved. An inappropriate composition of the proteasome types in tumor cells can lead to a lack of presentation and thus to immune escape. We have shown that neoplastic lymphatic cells express standard proteasome and immunoproteasome subunits in assembled proteasomes. Own unpublished analyses based on quantitative ELISA, demonstrated that blasts of patients, with AML and high tumor load express mainly immunoproteasomes (> 90%) and not standard proteasomes, most likely due to the influence of the inflammatory tumor environment. For therapeutic approaches with broad clinical application, therefore, epitopes which are only processed by one proteasome type may not be suitable. Micrometastases and so- called cancer stem cells (CSCs) may thus not be reached by T cell-based therapeutic approaches. Tumor spheres that served as an in vitro model for CSC enriched micrometastases showed downregulation or even loss of HLA molecules, most likely by epigenetic regulation at post-transcriptional level. Further studies on this are useful to clarify whether HLA expression can be restored by means of drugs that interfere with epigenetic regulation, such as DNA methyltransferase inhibitors or histone deacetylase inhibitors. In the second part of the work, the tumor-induced peripheral immunosuppression, its prognostic significance and possible modulation by tumor-specific therapy were investigated in patients with locally advanced melanoma and in patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC). Immune dysregulation is detectable with increasing tumor growth not only in the tumor microenvironment and the regional lymph nodes, but also systemically in the peripheral blood (pB) - even in locally advanced tumors, as demonstrated in this work, for malignant melanoma. Stage III melanoma patients treated adjuvant with PEG-IFNα-2b in the EORTC 18991 study had significantly higher TGFβ1 mRNA expression levels in pB compared to healthy controls, but more interestingly, without significant association with clinical or pathological characteristics, and without prognostic impact. However, higher mRNA expression levels of SOCS1 and SOCS3, inhibitors of the JAK / STAT signaling pathway, could be identified as prognostically unfavorable markers for both relapse-free survival and distant metastases-free survival. Further studies investigated peripheral immune dysregulation and its prognostic significance in mRCC patients who received the sorafenib tyrosine kinase inhibitor within an expanded access program. First, the focus was on immunosuppressive cytokines and cell populations. In comparison to a healthy control population, significantly increased mRNA expression levels of the immunosuppressive cytokines TGFβ1 and IL10 as well as increased frequencies of CD4+ CD25highFoxP3+ T cells, which are most likely to correspond to immunosuppressive regulatory T cells, were detected in mRCC patients. In a multivariate analysis, in addition to a low ECOG performance status score, a high mRNA expression of TGFβ1 was surprisingly identified as an independent favorable prognostic factor for progression-free survival (PFS) as well as overall survival (OS). In addition to immunosuppressive factors, changes in the frequency and function of immune effector cells of adaptive and innate immune responses can also play a role in tumor-induced immune dysbalance. In another study, the mRNA expression of the T-box transcription factor Eomes in pB that correlated with the expression of TGFβ1 in pB, was identified as an independent favorable prognostic factor for the PFS and OS of sorafenib-treated mRCC patients. Whether a higher mRNA expression of Eomes or TGFβ1 as an indicator of a favorable immunosignature in mRCC patients under targeted therapy is a useful marker, whether alone or in combination with already established clinicopathological characteristics or circulating angiogenic markers such as VEGF or cytokines, is still to be evaluated in a larger patient cohort in a prospective study. In vitro data have shown that TKIs such as sorafenib affect not only the specific signaling pathways in tumor cells, but also the corresponding signaling pathways in immune effector cells. In a cohort of 35 mRCC patients, the effect of sorafenib was studied in vivo. Sorafenib had no adverse effect on the type I T cell response, but was not able to convert the above-described immunosuppressive phenotype in the pB of mRCC patients. Sorafenib is thus a possible but not an optimal candidate for immunotherapeutic combination