Funktion von kleinen regulatorischen RNAs und der Codon-Verwendung bei der Regulation der RpoS (σS)- Untereinheit der RNA-Polymerase in Escherichia coli

Abstract

RpoS (σS) ist der Masterregulator der generellen Stressantwort und der stationären Wachstumsphase in E. coli und anderen γ-Proteobakterien. Als eine Untereinheit der RNA-Polymerase (RNAP) dirigiert σS diese an die Promotoren von Stress-protektiven Genen und reprogrammiert die zelluläre Transkription, um die Integrität und das Überleben zu sichern. Die Regulation von σS selbst ist komplex und vollzieht sich sowohl auf transkriptionaler, als auch auf translationaler Ebene, sowie auf der Ebene der σS-Stabilität und Aktivität (d.h. der RNAP-Holoenzymbildung). Phylogenetisch ist RpoS ein naher Verwandter des vegetativen Sigmafaktors RpoD (σ70), d.h. jenem Sigmafaktor, den es unter den Stressbedingungen innerhalb des RNAP-Holoenzyms ersetzt. Trotz ihrer großen Ähnlichkeit weisen RpoS und RpoD einen interessanten Unterschied bezüglich ihrer Codon-Usage auf. Die rpoS Sequenz enthält etwa doppelt soviele rare Codons wie die rpoD Sequenz, einschließlich elf rarer Codons, die in rpoD an homologen Positionen durch synonyme häufigere Codons repräsentiert werden. Der Austausch dieser elf raren Codons in rpoS durch die entsprechenden synonymen häufigeren rpoD Codons führte zu erniedrigten σS-Protein- und rpoS mRNA-Mengen. Mittels eines genetischen Ansatzes konnte gezeigt werden, dass die mRNA der rpoS Codonmutante mit den häufigeren Codons einen schnelleren RNase E-vermittelten Abbau aufweist als die mRNA des rpoS Wildtyps mit den natürlich auftretenden raren Codons. Weiterhin wurde demonstriert, dass die durch die raren Codons des Wildtyps vermittelte längere Halbwertszeit der rpoS mRNA unabhängig von anderen Regulationsmechanismen wie Transkription und Translationsinitiation ist. Die raren Codons in rpoS sind entlang der gesamten kodierenden Sequenz lokalisiert. Dies impliziert einen Mechanismus, indem durch das wiederholte transiente Pausieren von Ribosomen an den raren Codons das rpoS Transkript dichter mit Ribosomen beladen wird, wodurch die sterische Zugänglichkeit des Transkripts für die degradative RNase E vermindert wird. Eine Analyse der Sequenz anderer co-evolvierter Wachstumsphasen-abhängig exprimierter Isoenzympaare, sowie anderer Stationär- Phasen-assoziierter Gene offenbarte, dass das verstärkte Auftreten von raren Codons in stationäre Phase Genen ein möglicherweise generelleres Phänomen ist, um einen unökonomischen Abbau der entsprechenden mRNAs unter den limitierenden Bedingungen der stationären Wachstumsphase zu umgehen. Somit zeigt diese Arbeit neben den bekannten Aspekten der evolutionären Selektion zugunsten rarer Codons (z.B. effizientere co-translationale Proteinfaltung) einen zusätzlichen Aspekt auf: positive Selektion rarer Codons zugunsten der mRNA Stabilität. Die 5´-untranslatierte Region (5´-UTR) der rpoS mRNA faltet sich in eine Translations-inkompetente Sekundärstruktur, in der die Translationsinitiation- Region unzugänglich für die Ribosomen ist. In Antwort auf verschiedene Stressstimuli wird diese Sekundärstruktur mit Hilfe von kleinen nichtkodierenden regulatorischen RNAs (sRNAs) und dem RNA-Chaperon Hfq aufgeschmolzen, wodurch die rpoS Translation stimuliert wird. Es sind bisher drei sRNAs bekannt, welche die rpoS Translation aktivieren: RprA, DsrA und ArcZ. Zu Beginn dieser Arbeit war unbekannt, welche dieser charakterisierten sRNAs, oder aber ob eine andere sRNA an der bekannten translationalen Aktivierung von rpoS unter hyperosmotischem Stress und Säurestress beteiligt ist. Um solche potenziellen sRNA-Kandidaten zu identifizieren, wurde ein globaler Ansatz verfolgt, der auf einer Deep-Sequenzierungsanalyse von unter hyperosmotischen Stress mit Hfq co-immunopräzipitierter RNA basiert. In den sich anschließenden in vivo Funktionsanalysen wurde deutlich, dass die bekannte rpoS aktivierende sRNA DsrA die σS-Induktion unter Säure- und hyperosmotischem Stress, unabhängig von bereits beschriebenen σS-Regulatoren wie H-NS und RprA, vermittelt. In Einklang damit wurde gezeigt, dass DsrA selbst unter hyperosmotischem Stress verstärkt akkumuliert und unter diesen Bedingungen die rpoS Translation und als sekundäre Folge davon die Stabilisierung der rpoS mRNA positiv reguliert. Auffällig war, dass die rpoS mRNA sowohl in einer dsrA Mutante, einer rprA dsrA arcZ Tripelmutante, sowie in einer hfq Mutante immer noch hyperosmotisch induziert wird, also unter Bedingungen, in denen das rpoS Transkript aufgrund der ausbleibenden Translation destabilisiert werden sollte. Diese Beobachtungen und die Tatsache, dass die rpoS Transkriptionsinitiation von hyperosmotischem Stress, sowie einer hfq Deletion unbeeinflusst bleibt, deutete auf Mechanismen hin, welche die rpoS Transkription unter hyperosmotischem Stress positiv auf Ebene der Elongation regulieren. Konsistent mit dieser Hypothese war auch die Beobachtung, dass eine rpoS-Reportergenfusion unter der Kontrolle eines konstitutiven nicht Osmostress-sensitiven Promotors eine hyperosmotische Induktion des rpoS Reportergen- Transkripts aufwies. Alle diese Befunde deuten auf einen neuartigen Antiterminationsmechanismus durch Stress-induzierte Translation hin, deren genauer Mechanismus in zukünftigen Untersuchungen aufgeklärt werden muss.

RpoS (σS) is the master regulator of the general stress response and stationary growth phase in E. coli. As a subunit of RNA polymerase (RNAP), σS directs the latter to promoters of stress-protective genes, thereby reprogramming gene expression for maintenance and survival. Regulation of σS itself is complex and comprises transcriptional and translational regulation, as well as regulation of protein stability and activity (association with RNAP core enzyme). RpoS and the housekeeping sigma factor RpoD (σ70) are of common evolutionary origin and accordingly they share a big sequence similarity. Nevertheless, there is a striking difference concerning the codon usage of the two co-evolved sigma factors RpoS and RpoD. In contrast to the rpoD sequence, the rpoS sequence is enriched in rare codons (more than twice as many rare codons than rpoD). Particularly, there are eleven rare codons in rpoS, which are represented by more frequent synonymous codons at corresponding homologous positions in rpoD. Replacing these rare rpoS codons by the more common rpoD codons led to reduced rpoS mRNA half-life and σS protein levels. By using a series of endoribonuclease mutant strains, it was demonstrated that the rpoS transcript harboring the frequent codon allele (rpoS codon mutant) displayed an enhanced RNase E-dependent degradation compared to rpoS wild type mRNA containing the rare codons. Moreover, it was demonstrated that these rare codon-mediated increased mRNA stability was independent of other regulatory mechanisms, such as transcription and translation initiation. Rare codons within rpoS are located along the whole open reading frame. This implies a mechanism, in which slowing down translational elongation by stalled ribosomes at these rare codons ensures an enhanced ribosome density along the rpoS transcript, thereby reducing sterical access of degradative RNase E. The analysis of the sequences of other co-evolved growth phase-dependent induced pairs of isoenzymes, as well as other stationary phase associated genes, revealed that the occurrence of rare codons within stationary phase genes being possibly a more general feature in order to avoid a rapid mRNA turnover under conditions of limited resources. Therefore, this work highlights a new aspect of positive evolutionary selection in favor of rare codons, besides known aspects of positive evolutionary rare codon selection (e.g. more efficient co-translational protein folding): that is mRNA stability. By forming intramolecular base pairs, the rpoS mRNA 5´-untranslated region (5´-UTR) folds into a translationally incompetent stem-loop structure which masks the translation initiation region, thereby inhibiting ribosome access. Under certain stress conditions, this stem-loop structure is opened by base- pairing with small noncoding regulatory RNAs (sRNAs), which is facilitated by the RNA chaperone Hfq. Complex formation between the sRNAs and the rpoS 5´-UTR thus activates rpoS translation. Three sRNAs have been described that activate rpoS translation: RprA, DsrA and ArcZ. None of these sRNAs or another known or unknown sRNA has been implicated in the well known rapid translational induction of rpoS during hyperosmotic and acid stress. To identify such potential sRNA candidates, a global approach was chosen, based on deep sequencing of Hfq co-immunoprecipitated RNAs derived from cells subjected to hyperosmotic stress. Subsequent in vivo functional analysis demonstrated that the known rpoS activating sRNA DsrA is responsible for the hyperosmotic and acid induction of σS, independently from known σS regulators, such as H-NS and RprA. In accordance with this, DsrA itself accumulates under hyperosmotic stress, thereby positively regulating rpoS translation and, probably secondary to this, rpoS mRNA stability under this stress condition. Strikingly however, the rpoS transcript is still hyperosmotically induced in a dsrA mutant, a rprA dsrA arcZ triple mutant, as well as in an hfq mutant. These are conditions that strongly disfavor rpoS mRNA stability due to absent translation. The latter observation and the fact that initiation of rpoS transcription is not affected by hyperosmotic stress and a deletion of hfq suggested a mechanism that positively operates at the level of elongation of rpoS transcription under these conditions. Consistently, an rpoS reporter fusion under control of a non osmotic stress-sensing constitutive promoter yielded hyperosmotically induced rpoS fusion transcripts. Taken together, these results hint at a mechanism based on transcription antitermination by stress-induced translation. Future work will contribute to clarifying such a putative mechanism.