dc.contributor.author
Schwerdtfeger, Sverre Morten
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:05:03Z
dc.date.available
2017-03-13T09:12:56.094Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8842
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-13041
dc.description
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 9 1.1 Einführung und Taxonomie . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 1.2 Molekulare Grundlagen . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 1.2.1 NS1 und NS2
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.2.2
PB1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 12 1.2.3 Matrixproteine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 13 1.3 Neuraminidasen bei Orthomyxoviren und anderen
Pathogenen . . . . . . . . . . . 14 1.4 Hämagglutinin . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 1.5 Infektionszyklus –
Entritt, Replikation und Austritt . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 1.6
Pathogenese und Klinik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 21 1.7 Epidemiologie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 23 1.8 Prophylaxe . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 1.9 Antivirale Therapie &
Resistenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 1.9.1
Adamantane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28 1.9.2 Neuraminidaseinhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 29 1.9.3 Adjuvante Therapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . 32 1.10 Medikamente pflanzlichen Ursprunges . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . 32 1.11 Flavonoide . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 1.12 Problemstellung
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 2
Material 2.1 36 Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 36 2.1.1 Virusanzucht & NA-Inhibitions-Assay . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.1.2 Fluorometrie . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.1.3 Absorption . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.1.4
Bilddokumentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 36 2.2 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 36 2.3 Internetdienste . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.4 Verbrauchsmaterialien . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37 2.5 Influenzaviren
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.6 Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 37 2.7 Chemikalien & Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.8 Nährmedium . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.9 Infektionsmedium . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 2.10
Lösungen & Puffer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 39 2.10.1 Erythrozytenlösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 39 2.10.2 Avicel-Overlay . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.10.3 Fixier-Färbe-Lösung . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.10.4 MES . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 2.10.5
Stoplösung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 39 2.10.6 PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 39 2.10.7 PBS* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 39 2.11 Kits . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 2.12 Peptide . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40 2.13
Untersuchte Naturstoffe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 40 3 Methoden 3.1 44 Puffer & Lösungen . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.1.1 Substrat . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.1.2 Inhibitor . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.1.3
Lösungsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 44 3.1.4 Naturstofflösungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 44 3.2 MDCK-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.3 Virologische Methoden . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3.3.1 Virusanzucht . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45 3.3.2 Infektion
unter Anwesenheit von Inhibitor bzw. Testsubstanz . . . . . . . 45 3.3.3
Hämagglutinations-Test (HA-Test) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
45 3.3.4 Hämagglutinations-Elutions-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 46 3.3.5 Virustiterbestimmung mittels Plaque-Test . . . . . . . . . .
. . . . . . . . 46 3.3.6 Plaque-Reduktions-Test . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . 47 Neuraminidase-Inhibitions-Assay . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.4.1 NA-Aktivitätsbestimmung . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.4.2 Bestimmung der 50 %
inhibitorischen Konzentration (IC 50 ) . . . . . . . . 48 3.4.3 Mathematische
Auswertung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48 3.5
Enzymkinetische Messung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 48 3.6 Cytotoxizitätstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . 50 3.6.1 MTT-Test (Kit) . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 3.6.2 LDH-Test (Kit) . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 3.7 Selektivitätsindex .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51 3.8
Molekulares Modell zur Bindungsberechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . 52 3.9 Peptidsynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . 54 3.10 Peptidbindungsmodelle . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 3.4 4 Ergebnisse 4.1 55 Einfluss
der Naturstoffe auf die Neuraminidaseaktivität . . . . . . . . . . . . . . .
55 4.1.1 NA-Aktivitätsbestimmung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . 55 4.1.2 Einfluss von Amantadin und Oseltamivir auf die
Neuraminidaseaktivität . 56 4.1.3 Einfluss des Lösungsmittels DMSO auf die
Neuraminidaseaktivität . . . . 57 4.1.4 Einfluss von Calcium auf die
Neuraminidaseaktivität . . . . . . . . . . . . 57 4.1.5 Einfluss der
Naturstoffe auf die Neuraminidaseaktivität . . . . . . . . . . 57 4.2
Enzymkinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . 60 4.3 Einfluss von Kämpferol auf die Neuraminidase im
Hämagglutinations-Elutions-Test 63 4.4 Einfluss des Lösungsmittels auf die
Cytotoxizität von MDCK-Zellen . . . . . . . 63 4.5 Einfluss der Flavonoide auf
die Cytotoxizität von MDCK-Zellen . . . . . . . . . . 64 4.6 Plaque-
Reduktions-Test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. 64 4.7 Einfluss von Oseltamivir auf die Infektion und die Virusvermehrung .
. . . . . . . 69 4.8 Einfluss der Flavonoide auf die Infektion und die
Virusvermehrung . . . . . . . . 69 4.9 Molekulares Modell zur
Bindungsberechnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71 4.10 Peptide und
deren potentiellen Bindungsstellen am Hämagglutinin . . . . . . . . 73 4.11
Einfluss der Peptide auf die Infektion und die Virusvermehrung . . . . . . . .
. . 78 5 Diskussion 79 5.1 Naturstoffe inhibieren in unterschiedlichem Maße
die Neuraminidasen . . . . . . . 79 5.2 Kämpferol zeigt einen Einfluss auf die
Virusvermehrung . . . . . . . . . . . . . . 85 5.3 Bioverfügbarkeit von
Flavonoiden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87 5.4
Untersuchte Peptide scheinen die Infektion und die Virusvermehrung nicht zu
affektieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . 90 6 Zusammenfassung und Ausblick 93 7 Abstract 94 8
Abkürzungsverzeichnis 96 9 Literatur 98 Abbildungsverzeichnis 116
Tabellenverzeichnis 117 Rezepte gegen Grippe 118 Danksagung 120
dc.description.abstract
Zunehmende Resistenzen von Influenzaviren gegenüber den zugelassenen
Antiinfluenzaarznei- mitteln, wie die fast vollständig wirkungslosen
Adamantane oder die weitverbreitete H275Y Mutation mit der daraus
resultierenden Oseltamaivirresistenz, und weitere zu erwartende Re-
sistenzentwicklungen machen die Suche sowohl nach neuen
Neuraminidaseinhibitoren als auch anderen Zielstrukturen zur Inhibierung von
Infektion, Vermehrung und Ausbreitung der Viren notwendig. Zudem zeigen
Metaanalysen, dass der Neuraminidaseinhibitor Oseltamivir in der Klinik weit
weniger effektiv wirkt als ursprünglich angenommen. Da 70 % der in den letzten
25 Jahren in den USA eingeführten Medikamente auf einen pflanz- lichen
Ursprung zurückzuführen sind und nach wie vor nur ein geringer Teil der ca.
400.000 bekannten Arten (weniger als 1 % der Arten in den Tropen) auf ihr
therapeutisches Potential hin untersucht sind, bilden Substanzen pflanzlicher
Herkunft eine große Ressource, die es zu explorieren gilt. Polyphenole stehen
seit längerem im Fokus, da sie als sekundäre Metaboliten in einer Vielzahl von
Pflanzen vorkommen und hier u.a. der Pathogenabwehr dienen. Neben
antioxidativen und damit cytoprotektiven Eigenschaften kommen antimikrobielle
und antivirale Qualitäten hinzu. Obwohl einige der getesteten Naturstoffe die
Neuraminidase im MUNANA-Enzymassay zu in- hibieren vermochten, zeigte
ausschließlich Kämpferol einen Einfluss auf das Viruswachstum von
A(H1N1)pdm09, A(H3N2) und Flu B. Da bekannt ist, dass die Viren in vitro die
Neuraminidase zum Infizieren, Replizieren und Ausschleusen (Budding) aus der
Zelle nicht obligat benötigen, ist der Plaque-Reduktions-Test nur bedingt
aussagekräftig. Allerdings konnten die in dieser Ar- beit getesteten
Flavonoidglykoside (Hyperosid, Isoquercitrin, Luteolin-7-glucosid, Quercitrin
und Rutin) auch das Viruswachstum außerhalb des Plaque-Reduktionstests nicht
beeinflussen. Die cytotoxische Konzentration von Kämpferol lag über dem
doppelten Wert der 50 % inhibitorischen Konzentration, eine Cytotoxizität
konnte somit ausgeschlossen werden kann. Dennoch liegt die IC 50 des
Flavonoids mit drei Zehnerpotenzen deutlich über den therapeutischen
Konzentratio- nen der zugelassenen Neuraminidaseinhibitoren wie Oseltamivir,
Zanamivir und Peramivir. Ein möglicher Grund für die hohen IC 50 -Werte könnte
in der die Moleküle umgebende Hydrathülle liegen, die bei der Bindung ins
aktive Zentrum „abgestreift“ werden muß. Neben der Neuraminidase wurde auch
die Fusionssequenz im HA als potentielle Zielstruktur in den Fokus gerückt.
Diese Sequenz ist als Epitop für Antikörper nicht zugänglich und innerhalb der
verschiedenen Virusstämme hoch konserviert. Daher könnte mit einem
Arzneimittel, ohne vorherige Kenntnis des Virustyps, die Virusgrippe behandelt
werden. Das Virus würde zwar en- docytotisch in die Wirtszelle aufgenommen
werden, könnte aber nicht die notwendige Fusion der Virushülle mit der
Wirtszellmembran vollführen. Als potentielle Inhibitoren wurden zur Fusi-
onssequenz analoge Peptide synthetisiert, die in vitro jedoch keinerlei
Reduktion des Virustiters beobachten ließen. Nichtsdestotrotz sollte das
Fusionspeptid als Zielstruktur für eine antivirale Therapie weiter im Blick
behalten werden. Insgesamt scheinen Flavonoide zur systemischen antiviralen
Monotherapie auf Grund der benö- tigten hohen Konzentrationen eher ungeeignet.
Gleichwohl stellen sie einen interessanten Ansatz- punkt für eine topische
adjuvante Therapie dar, bei der neben der Behandlung von Influenzaviren auch
die von bakteriellen Superinfektionen und pathogeninduzierten cytopathischen
Effekten in- diziert ist. So könnte man die Stukturen modizfizieren, um
bessere Bindungseigenschaften zu erzielen. Zum Inhibieren der bakteriellen
Neuraminidase scheinen Hydroxylgruppen an den Po- sitionen 7, 5 und 4’, eine
Oxogruppe an Position 4 und eine Doppelbindung zwischen Position 2 und 3 im
C-Ring wichtig zu sein, wie es auch für die virale Neuraminidase postuliert
worden ist. Zur potenteren Hemmung der viralen Neuraminidase wäre es sinnvoll,
die Hydroxylgruppen auf ein für stabile Bindungen notwendiges Maß zu
reduzieren, um die Hydrathülle so klein als mög- lich zu halten und damit die
Energie zur Desolvierung zu reduzieren und die Bindungseffizienz zu erhöhen.
In diesem Rahmen böte die Substition von Hydroxylgruppen durch Aminogruppen
eine weitere Möglichkeit zur Modifizierung. Grundsätzlich sind Flavonoide in
unterschiedlichem Ausmaß in der Lage sowohl die virale als auch die
bakterielle Neuraminidase zu inhibieren.
de
dc.description.abstract
Increasing resistance of influenza viruses to approved anti-influenza drugs,
such as the almost completely ineffective adamantanes or widespread H275Y
mutation resulting in resistance to oseltamivir, and further expected
development of resistance necessitate searching for both new neuraminidase
inhibitors as well as other target structures for the inhibition of infection,
pro- liferation and spreading of viruses. Additionally meta-analyses show that
the neuraminidase inhibitor oseltamivir is much less effective in a clinical
environment than originally assumed. Since 70 % of the drugs approved in the
last 25 years in the US are of herbal origin and only a small number of the
approximately 400,000 known species (less than 1 % of the species in the
tropics) have been tested for their therapeutic potential, substances of
herbal origin form a great resource that needs to be explored. Polyphenols
have been in focus for a long time since they are present in a variety of
plants as secondary metabolites and, among other things, support pathogen
defence. In addition to antioxidant and thus cytoprotective properties,
polyphenols also have antimicrobial and antiviral qualities. Although some of
the tested natural substances were able to inhibit neuraminidase in MUNANA
enzyme assay, only kaempferol showed an impact on the growth of influenza
virus A(H1N1)pdm09, A(H3N2) and FluB. Since it is known that the virus in
vitro does not need neuraminidase obligatory for infecting, replicating and
budding from the cell, the plaque reduction assay is of limited significance.
However, in this study the tested flavonoid glycosides (hyperosid,
isoquercitrin, luteolin-7-glucoside, quercitrin and rutin) could not affect
the viral growth outside the plaque reduction tests. The cytotoxic
concentration of kaempferol was greater than twice the value of 50 %
inhibitory concentration. Thus cytotoxicity can be excluded. Nevertheless, the
IC 50 of flavonoids is by three orders of magnitude significantly higher than
the therapeutic concentrations of approved neuraminidase inhibitors such as
oseltamivir, zanamivir and peramivir. One possible reason for the high IC 50
values could be the necessity of desolvation of the molecules prior to binding
in the active site of neuraminidase. In addition to the neuraminidase, the
fusion sequence in HA was focused as a potential tar- get. This sequence is
not accessible as an epitope for antibodies and is highly conserved within the
different virus strains. Thus the virus flu could be treated without knowing
the exact virus type. The virus would be endocytosed into the host cell but
would not be able to carry out the necessary fusion of the viral envelope with
the host cell membrane. Analogous to the fusion sequence, synthesized peptides
did not reduce the virus titer in vitro. Nevertheless, the fusion peptide
should be kept in focus as a target for antiviral therapy. In summary,
flavonoids seem to be rather unsuitable for systemic antiviral monotherapy due
to the required high concentrations. Nevertheless, they are interesting for
topical adjuvant therapy which is indicated in addition to the treatment of
influenza viruses and pathogen-induced cyto- pathic effects of bacterial
superinfection. Thus the structure could be modified to achieve better binding
properties. For inhibiting bacterial neuraminidase hydroxyl moieties at the
positions 7, 5 and 4’, an oxo moiety at position 4 and a double bond between
positions 2 and 3 in C-ring seem to be important as it has been postulated for
viral neuraminidase. For more potent inhibition of viral neuraminidase, the
hydroxyl moieties should be reduced to an amount necessary for stable bonds,
keeping the hydration as low as possible, thereby reducing the energy required
for de- solvation and increasing the binding efficiency. The substitution of
hydroxyl moieties by amino moieties would be another possibility of
modification. Basically flavonoids in varying degrees are capable of
inhibiting both the viral and bacterial neuraminidase.
en
dc.format.extent
119 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
influenza virus
dc.subject
haemagglutinin
dc.subject
fusion peptide
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::579 Mikroorganismen, Pilze, Algen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::615 Pharmakologie, Therapeutik
dc.title
Charakterisierung potentieller Inhibitoren von Influenzaviren unter besonderer
Berücksichtigung der viralen Neuraminidase und des Fusionspeptids
dc.contributor.contact
smschwer@zedat.fu-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Matthias F. Melzig
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Bastian Opitz
dc.date.accepted
2017-03-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000104333-8
dc.title.translated
Characterisation of potential inhibitors of influenza virus in consideration
of viral neuraminidase and fusion peptide
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000104333
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000021182
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access