In dieser Arbeit wurde die Urat-Oxidase-Mutante (uox) von Arabidopsis thaliana charakterisiert. Urat-Oxidase (UOX) ist ein peroxisomales Enzym des Purinringkatabolismus, welches die Oxidation von Harnsäure zu 5-Hydroxyisourat katalysiert. UOX wird während der späten Embryonalentwicklung und im Keimling, aber auch in Blättern, Wurzeln und Blüten exprimiert. In jeder Nullmutante des Purinringabbaus akkumuliert das Substrat des betroffenen Enzyms, aber unter Standardwachstumsbedingungen zeigt nur uox einen auffälligen Phänotyp: Die Keimungsrate ist verringert und die Keimlinge bleiben auf Erde in einem unentwickelten Stadium stecken. Die Keimlinge können die Speicherlipide der Kotyledonen nicht mobilisieren, bilden keine Primärwurzel und die Keimblätter ergrünen nicht. Daher benötigen sie Zuckerzusatz im Medium, um zur Autotrophie zu gelangen. Der uox-Phänotyp tritt in der Xanthin-Dehydrogenase-Mutante (xdh) nicht auf und ist in xdh uox komplett revertiert. Somit ist weder der Ausfall des Purinringabbaus, noch eine etwaige strukturelle Funktion von UOX in Peroxisomen für den Phänotyp verantwortlich. Eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Harnsäure in Pflanzengeweben wurde entwickelt und zeigte ihr Vorkommen ausschließlich in allen Geweben von uox, vor allem aber ihre Anhäufung in sich entwickelnden Samen. In xdh- und xdh uox-Samen akkumulierte Xanthin in vergleichbarer Konzentration, ohne einen vom Wildtyp abweichenden Phänotyp zu verursachen. Im Gegensatz zu anderen Oxopurinen, wie Xanthin, hat Harnsäure offenbar eine toxische Wirkung auf die Samen- und Keimlingsentwicklung. Eine Metaboliten-Analyse von Samen wurde durchgeführt. Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie zeigte einen drastisch erhöhten Gehalt an Uridin und Sorbitol/Galaktitol in uox. Letzteres deutet auf starken osmotischen Stress während der Austrocknungsphase der uox Samen hin. Eine Lipidanalyse mittels Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie zeigte in uox signifikant mehr freie Fettsäuren aber weniger Glycerophospholipide und kurzkettige Triacylglyceride verglichen mit Wildtyp- und xdh uox-Samen. Transmissionselektronenmikroskopie von Kotyledonen aus Samen zeigte eine veränderte Morphologie der Proteinspeichervakuolen in uox mit Einschlüssen unbekannter Zusammensetzung, wohingegen xdh uox dem Wildtyp glich. Gleichzeitig wurde mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Gehalt an Speicherproteinen, wie Cruciferin, in uox-Samen signifikant verringert gefunden. Eine konfokalmikroskopische Analyse verschiedener uox-Linien, in denen die Peroxisomen GFP-markiert waren, zeigte einen fortschreitenden Verlust der Zahl der punktförmigen GFP Signale während der späten Samenentwicklung, zeitlich beginnend nach der Harnsäure-Akkumulation. In Embryonen aus uox-Samen wies die Mehrzahl der Kotyledonen keine oder nur wenige funktionale Peroxisomen auf. Hypokotyle waren weniger stark betroffen, hier waren apikal häufig noch GFP-Signale vorhanden. Der peroxisomale Defekt in uox Kotyledonen wurde durch den zytochemischen Katalasenachweis mit Diaminobenzidin (DAB) bestätigt. Während Wildtyp und xdh uox vergleichbar zahlreiche DAB-Signale in Semidünnschnitten von Keimblättern zeigten, fehlten diese in uox-Präparaten. Zusammenfassend zeigen die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse, dass die Harnsäure-Akkumulation während der Samenentwicklung von uox die wahrscheinliche Ursache für den Funktionsverlust von Peroxisomen in Kotyledonen und Hypokotylen ist, was dann den Keimungsdefekt in uox-Samen und das Ausbleiben der Autotrophie bei uox-Keimlingen zur Folge hat.
In this study, a urate oxidase mutant of Arabidopsis thaliana (uox) was characterized. Urate oxidase (UOX) is a peroxisomal enzyme involved in purine ring catabolism which catalyzes the oxidation of uric acid to 5-hydroxyisourate. UOX is expressed in late embryogenesis and during germination of the seedling, but also at later stages in leaves, roots and flower parts. In each of the mutants of purine ring degradation the substrate of the affected enzyme accumulates, but under standard growth conditions only uox shows a characteristic phenotype. Its germination rate is low and the seedlings are arrested in their growth on soil at an early stage. The seedlings fail to mobilize their lipid reserves and do not develop a primary root or green cotyledons. Therefore they need an external sugar supply to become autotrophic. As xdh (the xanthine dehydrogenase mutant) and xdh uox look normal, the lack of purine degradation itself or a structural function of UOX in peroxisomes can be ruled out as the cause of the uox phenotype. A colorimetric method to quantify uric acid in plant tissues was established and demonstrated its accumulation exclusively in all tissues of uox, but most prominently in developing and mature seeds. The assay showed a comparable accumulation of xanthine (the substrate of XDH) in seeds of xdh and xdh uox without causing any obvious phenotype. Obviously uric acid exerts a toxic effect during seed and seedling development whereas other oxopurines like xanthine do not. A metabolic profiling of seeds was performed. Gas chromatography coupled to mass spectrometry revealed a drastic elevation of uridine and sorbitol/galactitol in the seeds of uox. The latter indicates increased osmotic stress during the desiccation phase. Lipid analysis by ultraperformance liquid chromatography showed a significant increase of free fatty acids, but a decrease in the content of glycerophospholipids and short- chain triacylglycerides in uox in comparison to seeds of wild type and xdh uox. Transmission electron microscopy of cotyledons dissected from seeds revealed an altered morphology of protein storage vacuoles in uox with inclusions of unknown composition whereas xdh uox resembled the wild type. At the same time, with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, the content of storage proteins like cruciferin was found to be significantly lower in uox seeds. Confocal laser scanning microscopy of uox lines, in which GFP is targeted to peroxisomes, revealed a progressive loss of punctiform GFP signals in uox during late seed development, starting after the accumulation of uric acid. In mature embryos dissected from dry seeds of uox, most cotyledons contained none or only few functional peroxisomes. Hypocotyls were less affected, often displaying GFP signals in the apical part. The peroxisomal defect in cotyledons of uox was confirmed by cytochemical staining for catalase with diamino benzidine (DAB), which demonstrated numerous DAB-signals in semi thin sections of cotyledons of wild type and xdh uox but none in preparations of uox. In summary, the results of this study indicate that the accumulation of uric acid during seed development in uox is the likely cause of the loss of peroxisomal function in cotyledons and hypocotyls, which then leads to the germination defect in seeds of uox and the failure of uox seedlings to establish.