Mechanismus der 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 induzierten Apoptose in humanen Keratinozyten

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 induzierten Apoptose in humanen Keratinozyten untersucht. Dies erfolgte anhand von verschiedenen Methoden auf unterschiedlichen zellulären Ebenen. Es konnte gezeigt werden, daß 1a,25-(OH)2D3 seine Wirkung in humanen Keratinozyten wie Zellwachstumshemmung und Auslösen der Apoptose über die Steigerung der TNFa- Genexpression entfaltet. Nach Behandlung der Zellen mit 1a,25-(OH)2D3 ist eine erhöhte TNFa-mRNA zu detektieren, der in Protein translatiert wird. Das entstandene TNFa-Protein wird sezerniert und wirkt autokrin über seinen 55 kDa-Rezeptor auf die Zelle. In Abb. 26 ist der Ablauf schematisch dargestellt. Werden die Zellen mit einem neutralisierenden Antikörper gegen den 55 kDa- TNFa-Rezeptor vorbehandelt, so wird die von 1a,25-(OH)2D3 bewirkte Zellproliferationshemmung und Apoptose teilweise blockiert. TNFa löst in HaCaT-Zellen die Sphingomyelin-Hydrolyse aus, wobei Ceramid entsteht, daß als Second Messenger das Signal in das Zellinnere weiterleitet. Die Herabsetzung der basalen Ceramidkonzentration über Fumonisin B1, einem spezifischen Inhibitor eines Enzyms der Ceramid-Biosynthese, der Sphingosin-N-Acyltransferase, wirkt der 1a,25-(OH)2D3-verursachten Apoptose entgegen. Exogen zugegebene zellpermeable Ceramidanaloga wie C2-Cer=O (N-Acetylsphingosin), C2-Cer=S (N-Thioacetylsphingosin) und FS-5 (4 -Dodecanoylamino-decan-5-ol) führen ebenfalls zur Proliferationshemmung und Apoptose in HaCaT-Zellen, wobei die Analoga C2-Cer=O und C2-Cer=S starke Agonisten und FS-5 ein schwacher Agonist der Proliferationshemmung und Apoptose ist. Die schwache Wirkung von FS-5 ist höchstwahrscheinlich auf die fehlende Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 des Sphingosinrückgrates zurückzuführen.

Neben 1a,25-(OH)2D3 wurden auch seine Analoga EB 1213, GS 1500, Tacalcitol und Calcipotriol in HaCaT-Zellen untersucht. Alle vier Analoga bewirkten ebenfalls die Sphingomyelin-Hydrolyse, wobei bei EB 1213 die Hydrolyse auch noch nach 6 h Behandlung zu messen war. Weiterhin wirkten die Analoga antiproliferativ und Apoptose-induzierend. Jedoch war nur EB 1213 in der Lage die mRNA für TNFa zu steigern, was dadurch zu erklären wäre, daß die Analoga unterschiedliche Promoterselektivität besitzen.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Mechanismus der 1a,25-Dihydroxyvitamin D3 induzierten Apoptose in humanen Keratinozyten untersucht. Dies erfolgte anhand von verschiedenen Methoden auf unterschiedlichen zellulären Ebenen. Es konnte gezeigt werden, daß 1a,25-(OH)2D3 seine Wirkung in humanen Keratinozyten wie Zellwachstumshemmung und Auslösen der Apoptose über die Steigerung der TNFa- Genexpression entfaltet. Nach Behandlung der Zellen mit 1a,25-(OH)2D3 ist eine erhöhte TNFa-mRNA zu detektieren, der in Protein translatiert wird. Das entstandene TNFa-Protein wird sezerniert und wirkt autokrin über seinen 55 kDa-Rezeptor auf die Zelle. In Abb. 26 ist der Ablauf schematisch dargestellt. Werden die Zellen mit einem neutralisierenden Antikörper gegen den 55 kDa- TNFa-Rezeptor vorbehandelt, so wird die von 1a,25-(OH)2D3 bewirkte Zellproliferationshemmung und Apoptose teilweise blockiert. TNFa löst in HaCaT-Zellen die Sphingomyelin-Hydrolyse aus, wobei Ceramid entsteht, daß als Second Messenger das Signal in das Zellinnere weiterleitet. Die Herabsetzung der basalen Ceramidkonzentration über Fumonisin B1, einem spezifischen Inhibitor eines Enzyms der Ceramid-Biosynthese, der Sphingosin-N-Acyltransferase, wirkt der 1a,25-(OH)2D3-verursachten Apoptose entgegen. Exogen zugegebene zellpermeable Ceramidanaloga wie C2-Cer=O (N-Acetylsphingosin), C2-Cer=S (N-Thioacetylsphingosin) und FS-5 (4 -Dodecanoylamino-decan-5-ol) führen ebenfalls zur Proliferationshemmung und Apoptose in HaCaT-Zellen, wobei die Analoga C2-Cer=O und C2-Cer=S starke Agonisten und FS-5 ein schwacher Agonist der Proliferationshemmung und Apoptose ist. Die schwache Wirkung von FS-5 ist höchstwahrscheinlich auf die fehlende Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 des Sphingosinrückgrates zurückzuführen.

Neben 1a,25-(OH)2D3 wurden auch seine Analoga EB 1213, GS 1500, Tacalcitol und Calcipotriol in HaCaT-Zellen untersucht. Alle vier Analoga bewirkten ebenfalls die Sphingomyelin-Hydrolyse, wobei bei EB 1213 die Hydrolyse auch noch nach 6 h Behandlung zu messen war. Weiterhin wirkten die Analoga antiproliferativ und Apoptose-induzierend. Jedoch war nur EB 1213 in der Lage die mRNA für TNFa zu steigern, was dadurch zu erklären wäre, daß die Analoga unterschiedliche Promoterselektivität besitzen.

In the present study the mechanism of 1a,25-dihydroxyvitamin D3 (1a,25-(OH)2D3) induced apoptosis was investigated in human keratinocytes. This was done with different methods at distinct cellular levels. It could be demonstrated that 1a,25-(OH)2D3 mediated its effect on cell proliferation and apoptosis in human keratinocytes via upregulation of tumor necrosis factor (TNF) a gene expression. After treatment of cells with 1a,25-(OH)2D3 increased TNFa mRNA is detected, which is then translated into protein. TNFa protein is secreted and it affects the cell through an autocrine mechanism via the 55 kDa receptor. When cells are preincubated with neutralizing antibodies against the 55 kDa TNFa-receptor, the 1a,25-(OH)2D3 induced inhibition of cell proliferation and apoptosis are partially blocked. TNFa leads to sphingomyelin hydrolysis in HaCaT cells, whereby ceramide is generated, which as a second messenger transduces the signal into the cell. The reduction of the basal ceramide concentration with fumonisin B1, a specific inhibitor of an enzyme in the ceramide biosynthesis, the sphinganin-N-acyltransferase, antagonizes 1a,25-(OH)2D3-induced apoptosis. Exogenously applied cellpermeable ceramide analogues such as C2-Cer=O (N-acetylsphingosine), C2-Cer=S (N-thioacetylsphingosine) and FS-5 (4-dodecanoylamino-decan-5-ol) lead also to inhibition of cell growth and apoptosis in HaCaT cells, whereas the analogues C2-Cer=O and C2-Cer=S are strong agonists and FS-5 a weak agonist of the inhibition of proliferation and apoptosis. The weak effect of FS-5 could be most probably explained by the lack of the double bond between carbon atom 4 and 5 of the sphingosine backbone.

In addition to 1a,25-(OH)2D3 its analogues EB 1213, GS 1500, Tacalcitol and Calcipotriol were also tested in HaCaT cells. All four analogues caused sphingomyelin hydrolysis, whereas with EB 1213 the hydrolysis was detectable even after 6 h of treatment. Furthermore, the analogues were shown to be antiproliferativ and proapoptotic. Nevertheless, only EB 1213 could upregulate the mRNA for TNFa, which could be explained by the fact that the analogues have different promotor selectivity.