dc.contributor.author
Fendler, Annika
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:01:43Z
dc.date.available
2011-10-12T13:30:47.842Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8771
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12970
dc.description
1\. Introduction 1 1.1 microRNAs 1 1.1.1 History of microRNAs 1 1.1.2 microRNA
genomic location and biogenesis 1 1.1.3 Mechanisms of miRNA mediated gene
silencing 3 1.2 Prostate cancer 5 1.2.1 Clinical definition, etiology and
pathobiology 5 1.2.2 Prostate cancer diagnosis 7 1.2.3 Prostate cancer
prognosis 7 1.2.4 Prostate cancer therapy 8 1.2.5 Prostate cancer biology 9
1.3 miRNA regulation in cancer 11 1.3.1 miRNA profiling and their utilization
as molecular markers 11 1.3.2 Regulation of miRNA expression 13 1.3.3 Function
of miRNAs in carcinogenesis 14 1.3.4 miRNAs as putative therapeutics 18 1.4
Thesis aims 22 2\. Material and methods 23 2.1 Material 23 2.1.1 Equipment 23
2.1.2 Consumables 23 2.1.3 Chemicals, reagents and kits 23 2.1.4 Buffers,
solutions and cell culture media 25 2.1.6 Oligonucleotides 27 2.1.8 Expression
vectors and synthetic microRNAs 29 2.1.7 Antibodies 31 2.1.5 Bacteria 31 2.1.5
Cell lines 31 2.2 Methods 33 2.2.1 Tissue 33 2.2.1.1 Fresh frozen tissue 33
2.2.1.2 Formalin-fixed, paraffin-embedded tissue 33 2.2.1.3 Tissue Microarray
33 2.2.2 Molecular biology 34 2.2.2.1 RNA extraction 34 2.2.2.2 Plasmid
isolation 35 2.2.2.3 miRNA Microarray analysis 35 2.2.2.4 TaqMan low density
miRNA array 36 2.2.2.5 Real time quantitative PCR 36 2.2.2.6 Amplification of
3’ UTR sequences by PCR 39 2.2.2.7 Bacterial PCR 40 2.2.2.8 Agarose gel
electrophoresis 40 2.2.2.9 Construction of luciferase reporter vectors 40
2.2.3 Cell Biology 42 2.2.3.2 Transient transfection with synthetic pre-miRNAs
and antisense inhibitors 42 2.2.3.4 MTT and XTT assays for metabolic activity
detection 43 2.2.3.5 Detection of apoptotic cells by flow cytometry 43 2.2.3.6
Detection of cell cycle progression by flow cytometry 44 2.2.3.7 Wound-healing
Assay 44 2.2.3.8 Luciferase reporter gene assay 44 2.2.3.9 R1881 treatment of
androgen-dependent prostate cancer cells 45 2.2.4 Biochemistry 45 2.2.4.1
Protein extraction 45 2.2.4.2 Measurement of total protein after Bradford 45
2.2.4.3 SDS-PAGE 45 2.2.4.4 Western blotting and immunostaining 45 2.2.4.5
Immunhistochemistry 46 2.2.4.6 Haematoxylin/Eosin staining 47 2.2.5
Statistical Analysis 47 3\. Results 48 3.1 miRNA profiling in prostate cancer
48 3.1.1 Patients and tumor characteristics 48 3.1.2 miRNA microarray
expression analysis 49 3.1.3. Identification of suitable endogenous control
genes for miRNA expression analysis 50 3.1.4 Validation of differentially
expressed miRNAs using RT-qPCR 54 3.1.5 Clinical relevance of miRNA expression
56 3.1.5.1 Association of miRNAs with clinico-pathological data 56 3.1.5.2
miRNAs as diagnostic markers for prostate cancer detection 57 3.1.5.3 miRNAs
as prognostic markers for prostate cancer biochemical recurrence 59 3.1.5.4
miRNAs in formalin-fixed, paraffin-embedded prostate cancer tissue for risk
stratification after radical prostatectomy 63 3.2 Functional relevance of
miRNAs in prostate cancer 68 3.2.1 In silico target prediction for prostate
cancer-related miRNAs 68 3.2.2 miRNAs in cancer progression 69 3.2.3 Androgen-
dependent regulation of miRNA expression 71 3.2.4 miR-96: an oncogenic miRNA
in prostate cancer 72 3.3.4.1 Regulation of apoptosis by miR-96 73 3.2.4.2
miR-96 as an effector of apoptosis-related genes 77 3.2.5 miR-133b is a
negative regulator of prostate cancer carcinogenesis 86 3.2.5.1 Expression of
miR-133b in prostate cancer 86 3.2.5.2 Functional relevance of miR-133b in
prostate cancer 88 3.2.5.3 Regulation of gene expression by miR-133b 89
3.2.5.4 Correlation of the expression of miR-133b and target genes in prostate
cancer tissue 94 4\. Discussion 96 4.1 miRNA profiling 96 4.1.1 Identification
of suitable reference genes 96 4.1.2 Identification of dysregulated miRNAs in
prostate cancer 98 4.1.3 Identification of dysregulated miRNA in prostate
cancer relapse 101 4.2 Functional relevance of miRNAs in prostate cancer 103
4.2.1 In-silico target prediction 103 4.2.2 miRNA regulation by androgens 104
4.2.3 Combination of computational and experimental methods to confirm the
function of miR-10b in prostate cancer recurrence 105 4.2.4 The regulation of
apoptosis by miR-96 and FOXO1 in prostate cancer 106 4.2.5 Characterization of
miR-133b in prostate cancer 109 5\. Conclusion and outlook 113 References 115
Acknowledgments 142
dc.description.abstract
microRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that are crucial regulators of
carcinogenesis. In this thesis, the deregulation of miRNAs in prostate cancer
was investigated. miRNA microarray profiling was performed in fresh frozen
prostate cancer and matched normal adjacent tissues. Differentially expressed
miRNAs were subsequently validated by real-time quantitative PCR (RT-qPCR).
Fifteen miRNAs differentially regulated in prostate cancer in comparison with
normal tissue. Expression of 5 miRNAs was correlated with the pathological
stage and the Gleason score. The diagnostic potential was calculated by
receiver operating characteristic curves and logistic regression. Two miRNAs
alone correctly classified 84% of malignant and non-malignant samples. The
prognostic value of the miRNAs in prostate cancer specimens after radical
prostatectomy was calculated by a Kaplan-Meier analysis and a multivariate Cox
regression analysis. miR-96 expression was associated with biochemical
relapse, which is defined as an increased value of prostate-specific antigen
after surgery and which is indicative of prostate cancer recurrence. The
prognostic value of miR-96 was validated with an independent sample set. The
multivariate Cox regression analysis confirmed that miR-96 expression is an
independent marker of biochemical relapse. To further identify miRNAs
concurrent with a biochemical relapse, miRNA profiling was performed in
formalin-fixed, paraffin-embedded tissues from biochemical relapse patients.
The deregulation of miR-10b and miR-222 in patients experiencing an early
biochemical relapse was validated by RT-qPCR. Based on the profiling studies
and the important role of miR-96 as a prognostic marker, miR-96 function was
investigated. miR-96 overexpression increased proliferation and impaired
apoptosis of LNCaP prostate cancer cells upon induction by camptothecin. In-
silico target prediction identified putative apoptosis-related target genes,
among them FOXO1 and ITPR1. The direct binding of miR-96 to the FOXO1 3’ UTR
was shown by a reporter gene assay and resulted in a downregulation of the
FOXO1 transcript and protein. The binding of miR-96 to the ITPR1 3’ UTR was
only shown for the second predicted binding site. miR-96 expression was
inversely correlated with FOXO1 protein expression in prostate cancer and
matched normal adjacent tissue. A second miRNA, miR-133b, was functionally
characterized in this thesis. A collaborating group has previously identified
miR-133b as a regulator of extrinsic apoptosis. In this thesis, miR-133b is
shown to be downregulated in prostate cancer and an overexpression of miR-133b
in PC3 prostate cancer cells is described to impair proliferation. Microarray
profiling revealed that an abundance of genes was downregulated upon miR-133b
transfection. The downregulation of GSTP1, FAIM, CAV1 and VEGFC was verified
on transcript and protein levels. The direct binding of miR-133b to the CAV1
3’ UTR was not detected in a reporter gene assay, suggesting an indirect
regulation. miR-133b and FAIM transcript expression were inversely correlated,
whereas all other target genes were not correlated with miR-133b expression.
Therefore the regulation of these genes by miR-133b might be superimposed by
other regulatory mechanisms in prostate cancer. This thesis provides evidence
of the miRNA deregulation in prostate cancer and that differential miRNAs are
useful diagnostic and prognostic indicators. Furthermore, the regulatory roles
of miR-96 and miR-133b in apoptosis and proliferation in prostate cancer cells
are established for the first time in this cancer entity. These roles provide
new insights into prostate cancer carcinogenesis.
de
dc.description.abstract
miRNAs sind kurze nicht-protein-kodierende RNAs und wichtige Regulatoren der
Karzinogenese. In dieser Arbeit wurde die miRNA-Expression im Prostatakarzinom
untersucht. Mit einem Microarray wurde ein miRNA-Profil in gepaartem Prostata-
und angrenzendem Normalgewebe erstellt und mittels RT-qPCR validiert. 15
miRNAs waren im Prostatakarzinom unterschiedlich exprimiert. Die Expression
von 5 miRNAs korrelierte mit dem histologischen Differenzierungsgrad nach
Gleason und dem pathologischen Tumorstadium. Das diagnostische Potential aller
miRNAs wurde mit Hilfe von „Receiver Operating Characteristics“ Kurven und
logistischer Regression berechnet. Schon die Kombination zweier miRNAs konnte
84% aller malignen und nicht-malignen Proben richtig klassifizieren. Die
Expression der miR-96 war in der Kaplan-Meier-Analyse mit einem biochemischen
Rezidiv, definiert als Wiederanstieg des prostataspezifischen Antigens nach
radikaler Prostatektomie, assoziiert. Der prognostische Wert dieser miRNA
wurde in einer unabhängigen Kohorte validiert. Multivariate Cox
Regressionsanalysen bestätigten, dass die Expression der miR-96 ein
unabhängiger Marker für ein biochemisches Rezidiv ist. Um weitere miRNAs zu
identifizieren, die mit einem biochemischen Rezidiv assoziiert sind, wurde ein
miRNA-Profil aus formalin-fixierten, paraffin-eingebetteten Gewebeblöcken von
Patienten mit einem biochemischen Rezidiv erstellt. Die Deregulation der miR-
10b und miR-222 in Patienten mit einem frühen Rezidiv wurde in der RT-qPCR
bestätigt. Auf Grund der Assoziation der miR-96 mit einem biochemischen
Rezidiv wurde die Funktion der miR-96 im Prostatakarzinom untersucht.
Induzierte miR-96-Überexpression in LNCaP-Zellen erhöhte deren Proliferation
und inhibierte die Apoptose in Camptothecin-behandelten Zellen. Durch in-
silico Prädiktion wurden mögliche Apoptose-assoziierte Zielgene identifiziert,
unter ihnen FOXO1 und ITPR1. Im Reportergenassay wurde eine direkte Bindung
zwischen der miR-96 und der FOXO1 3’-UTR bewiesen, welche mit einer
verminderten FOXO1 Transkript- und Proteinexpression einherging. Die
Expression miR-96 war invers mit der FOXO1-Protein-Expression im
Prostatakarzinomgewebe korreliert. Eine Bindung der miR-96 an die ITPR1 3’-UTR
konnte nur für die zweite Bindungsstelle nachgewiesen werden. Weiterhin wurde
die Funktion der miR-133b im Prostatakarzinom untersucht. Eine Studie unserer
Projektpartner hatte die regulatorische Funktion der miR-133b während der
extrinsischen Apoptose untersucht. In dieser Arbeit wurde eine verminderte
Expression der miR-133b im Prostatakarzinom nachgewiesen. Die Überexpression
dieser miRNA in PC3-Zellen inhibierte die Proliferation. In einem Microarray
war eine Vielzahl von Genen in miR-133b überexprimierenden PC3-Zellen
vermindert exprimiert. Die verminderte Expression von GSTP1, FAIM, FASN, CAV1
und VEGFC wurde auf Transkript- und Proteinebene verifiziert. Jedoch konnte
keine direkte Bindung der miR-133b an die CAV1 3’-UTR nachgewiesen werden, was
auf ein indirekte Regulation hindeutet. Die Expression der miR-133b und FAIM
korrelierte invers in Prostatageweben. Andere Zielgene waren nicht invers mit
der miRNA korreliert, vermutlich weil die Regulation der miR-133b durch andere
Regulationsmechanism überdeckt wird. Diese Arbeit beweist, dass das
Prostatakarzinom durch ein verändertes miRNA-Expressionsmuster charakterisiert
werden kann und dass miRNAs als diagnostische oder prognostische Marker
geeignet sind. Zudem wurde zum ersten Mal eine funktionelle Bedeutung der
miR-96 und miR-133b im Prostatakarzinom nachgewiesen. Damit vermittelt diese
Arbeit neue Einblicke in die Karzinogenese des Prostatakarzinoms.
de
dc.format.extent
XI, 142 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
prostate carcinoma
dc.subject
carcinogenesis
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
MiRNAs and prostate cancer
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Lein
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Mutzel
dc.date.accepted
2011-09-29
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000025311-1
dc.title.subtitle
Identification, functional characterization and their potential use in medical
practice
dc.title.translated
MiRNAs beim Prostatakarzinom
de
dc.title.translatedsubtitle
Identifikation, funktionelle Charakterisierung und ihre potentielle Anwendung
in der medizinischen Praxis
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000025311
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010078
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open access