Einleitung: Unter Endozytose versteht man einen Vorgang, in dessen Rahmen eine Zelle Stoffe aufnimmt, die sich im Extrazellulärraum befinden oder solche, die Teil der sich einstülpenden Membran sind. Tight Junctions (TJ, deutsch „Schlussleisten“) sind aus unterschiedlichen Transmembranproteinen aufgebaut und umgeben die laterale Membran von Epithelzellen gürtelförmig. Sie bilden u.a. eine parazelluläre Barriere, die Konzentrationsunterschiede von Substanzen der beiden Seiten des Epithels aufrechterhält. Verschiedene Zytokine sind in der Lage, diese parazelluläre Barriere zu verändern und Endozytose zu induzieren. Bislang etabliert ist dabei die Regulation der Transkription von TJ-Proteinen. Die Endozytose von TJ-Proteinen als eine weitere Regulationsoption der TJ-Funktion ist in der Diskussion. Zielsetzung: Ziel der Arbeit war es, die Rolle der Endozytose in der TJ-Funktion zu klären bzw. mechanistische Vorgänge, die dieser Funktion zugrunde liegen, zu unterbreiten und in ersten Experimenten zu stützen. Methodik: Die Barrierefunktion wurde nach Hemmung der Endozytose (Dynasore, Pitstop-2) und nach Inkubation der Epithelzellen mit Zytokinen untersucht. Es wurden drei Darmepithelzelllinien verwendet: T84, Caco-2, Caco-2-Claudin-5. Die Barrierefunktion wurde mittels Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) sowie des parazellulären Fluorescein-Flux untersucht. Ferner erfolgten Untersuchungen zur TJ-Integrität mittels konfokaler Laser-Scanning- Mikroskopie nach Immunfluoreszenz-Färbung der TJ-Proteine. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass Dynasore und Pitstop-2 zu einem statistisch signifikanten TER-Anstieg bzw. -Abfall führen. Eine Dynasore- bzw. Pitstopinkubation führte zu einer Verringerung der parazellulären Fluorescein Permeabilität. Beide Endozytoseinhibitoren führen zu einer Umverteilung oder veränderten Expression von TJ- oder TJ-assoziierten Proteinen. Die Zytokinversuche ergaben ein Ausbleiben einer frühen TER-Veränderung. Für die Inkubation der Epithelzellen mit IL-13 und IL-22 ergab sich eine statistisch signifikante TER-Reduktion nach 48 Stunden. Ein Rescue dieser Zytokin- assoziierten TER-Veränderungen durch parallele Inkubation mit einem Endozytosehemmer blieb aus. Die Immunfluoreszenzfärbungen zeigten eine Umverteilung und Expressionsänderung von TJ- und TJ-assoziierten Proteinen nach Zytokin-Inkubation. Schlussfolgerung: Die Wirkung der Endozytoseinhibitoren auf den TER zeigt, dass eine Regulation der parazellulären Barriere nicht nur durch die veränderte Transkription von TJ- Proteinen erreicht wird, sondern dass die Aufnahme dieser durch Endozytose ebenfalls eine Rolle spielt. Der Anstieg des TER hervorgerufen durch Dynasore müsste also am ehesten durch eine verstärkte Expression eines abdichtenden nicht im Rahmen dieser Arbeit untersuchten TJ-Proteins erfolgen oder durch die verringerte Expression des kanalbildenden Claudin-2. Bei Pitstop sinkt der TER ab, ebenso wie es zu einer Abnahme des parazellulären Fluorescein-Transports kommt. Der nach IL-13- und IL-22-Inkubation hervorgerufene TER-Abfall ließ sich nicht abschließend klären, die epitheliale Integrität zeigte sich erhalten, Apoptosen zeigten sich nicht und frühe Endozytose-Effekte nach Minuten ließen sich nicht nachweisen. (397 Wörter)
Introduction: Endocytosis is known as a process in which a cell takes in substances, that are situated in the extracellular space or that are part of the invaginated membrane. Tight Junctions (TJ) are composed out of various transmembrane proteins and encompass the lateral membrane in a belt-shaped manner. Amongst others, they form a paracellular barrier that preserves the gradient of different substances. Several cytokines have the ability to alter the TJ associated paracellular barrier and induce endocytosis. Furthermore, the endocytosis of TJ proteins as a regulation option of the TJ function is in discussion. Methods: The barrier function was examined after both inhibition of endocytosis (dynasore, pitstop-2) and incubation of the epithelium cells together with cytokine. Three cell lines were used: T84, Caco-2, Caco-2-Claudin-5. Measurement barrier function via the measurement of electrical resistance (TER) and the paracellular fluorescein-flux were used. Regarding TJ integrity it was further investigated through confocal laser- scanning-microscopy after immunofluorescence staining of the TJ proteins. Results: Dynasore and pitstop-2 lead to a statistical significant TER increase and decrease respectively. They both lead to a decline of paracellular fluorescein permeability. Both inhibitors lead to reallocation or altered expression of TJ or TJ associated proteins. The experiments with cytokine resulted in an absence of an early TER alteration. The incubation with IL-13 and IL-22 resulted in a statistically significant TER reduction after 48 hours. A rescue of the cytokine associated TER alteration through parallel incubation with dynasore failed. The immunofluorescence staining showed a reallocation and express alteration of TJ associated proteins after the incubation of cytokine. Conclusion: The effect of endocytosis inhibitors on TER shows that a regulation of paracellular barriers cannot only be accomplished through the altered transcription of TJ proteins, but also by the altered uptake of the TJ-proteins through endocytosis. The TER increase following the dynasore incubation should rather be investigated through an increased expression of a sealing TJ-protein (not investigated within the context of this dissertation) or through a reduced expression of the channel- forming Claudin-2. Pitstop-2 caused a TER descent and an alteration of the paracellular transport. The descent of TER induced by incubation of IL-13 and IL-22 could not finally be clarified; the epithelial integrity was preserved and early endocytosis effects after minutes could not be verified. (372 words)
