Identification and characterization of two novel proteins interacting with the chemokine- and HIV-1 co-receptor CCR5

Abstract

The chemokine- and HIV-1 co-receptor CCR5 belongs to a very important family of membrane receptors, the class of G protein-coupled receptor (GPCRs). Recent approaches have identified new receptor-interacting proteins that have shed new light on mechanisms of function and regulation of GPCRs. Using the cytoplamic C-terminus of CCR5 as a bait for a yeast two-hybrid screen we identified a-catenin and JM4 as novel interaction partners of CCR5. The a-catenin protein is an essential component and organizer of the cytoskeletal network and links different protein components. We demonstrated endogenous protein interactions in mammalian cells and additionally showed an endogenous interaction of a-catenin with the second major HIV-1 coreceptor CXCR4. Chemokine receptor activation induces the structural reorganization of the cytoskeleton. Our data suggest that a-catenin connects the chemokine receptors with the cellular cytoskeleton, thereby affecting chemokine receptor function, clustering, trafficking, modulation of the cytoskeleton, and possibly HIV-1 infection. The association of a-catenin and CCR5 is mediated by the C-termini of the proteins, as shown here in yeast two-hybrid analyses. In mammalian cells, full-length a-catenin and mutants were able to interact with the receptor. This indicates that a-catenin has further interaction sites. Alpha- catenin is known to form oligomers, it is hence also conceivable that the C-terminally deleted a-catenin mutant is bound indirectly via endogenous CCR5-associated a-catenin to the receptor. In this study we identified JM4 as a second novel interaction partner of CCR5 and further characterized this protein. JM4 is deposited in the database, but no biological function was assigned to it. JM4 is a membrane-associated protein with four putative membrane-spanning domains and has a tendency to form oligomers. In the database are proteins described that share sequence homologies of 35 % to 92 % with JM4. These proteins are conserved throughout different species and are putative four-transmembrane spanning proteins. We showed similar localization and distribution of JM4 and closely related proteins, such as human JWA and its rat homologue GTRAP3-18, in mammalian cells. JM4, JWA and GTRAP3-18 did form homo- and hetero-oligomers. Therefore, it is possible that these proteins can substitute for each others biological function. This is furthermore indicated by the fact that JWA associated with similar efficiency as JM4 to CCR5. GTRAP3-18 binds to and regulates the cellular glutamate transporter EAAC1 as shown by group of Prof. Rothstein, Johns Hopkins Medical Institutions, USA. In a recent collaboration with this group we could show that, like GTRAP3-18, JM4 can regulate the transporter-mediated cellular uptake of glutamate. Based on these observations, we hypothesize that JM4, JWA and GTRAP3-18 constitute a new protein family, of which the members are involved in the regulation of transmembrane receptors and transporter proteins. To compare the biologal functions of JM4 and GTRAP3-18 the collaboration with Prof. Rothstein will be continued. The interaction of JM4 and CCR5 was dependent on intact C-termini of both proteins in yeast. Additional intramolecular docking sites of CCR5 could play a role in mediating the interaction with JM4, as studies using deletion mutants have shown. In other studies we analyzed the effect of overexpression of a-catenin and JM4 on CCR5 activities, such as chemokine-induced actin polymerisation, receptor internalization, and receptor-mediated HIV-1 infection. Other species of retroviruses utilze multi-transmembrane amino acid transporters, that share sequence and structure-based homologies with the JM4- and GTRAP3-18-regulated glutamate transporter EAAC1, for cellular entry. We have initiated a collaboration with Prof. Weiss, University College London, UK, to test for a general role of JM4, JWA, and GTRAP3-18 in virus infection.

Der Chemokin-Rezeptor und HIV-1 Korezeptor CCR5 gehört zur überaus bedeutsamen Familie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die in letzter Zeit erfolgte Identifizierung neuer Rezeptor-interagierender Proteine hat zur Aufklärung der Funktionsmechanismen dieser Rezeptoren und deren Regulation beigetragen. In einem Hefe 2-Hybrid System konnten wir a-catenin und JM4 als neue CCR5-interagierende Proteine identifizieren. Alpha-catenin ist ein essentieller Bestandteil und Organisator des zellulären Zytoskeletts und verbindet als Adaptormolkül verschiedene Proteinkomponenten miteinander. Die Assoziation mit CCR5 wurde mit exogenen und endogenen Proteinen gezeigt. Zudem interagierte nicht nur CCR5, sondern auch CXCR4, ein weiterer wichtiger HIV-1 Korezeptor, mit a-catenin. Die Aktivierung von Chemokin-Rezeptoren bewirkt eine strukturelle Reorganisation des Zytoskelett. Die Chemokin-Rezeptoren sind über a-catenin möglicherweise mit dem Zytoskelett verbunden. Somit kann die Bindung von a-catenin an CCR5 bedeutsam sein für Rezeptorfunktion, für Multimerisierung und intrazellulären Transport des Rezeptors, Modulation des Zytoskeletts sowie für die HIV-1 Infektion. Im Hefe 2-Hybrid System wurde hier gezeigt, dass die Assoziation von a-catenin und CCR5 durch die C-terminalen Enden der beiden Proteine vermittelt wird. In Säugertierzellen interagierten sowohl a-catenin, als auch Deletionsmutanten. Dieser Befund deutet darauf hin, dass weitere Bindungststellen auf dem a-catenin Molekül vorhanden sein könnten. Da a-catenin oligomerisien kann, ist es auch möglich, dass die Interaktion der C-terminalen Deletiontsmutante mit dem Rezeptor indirekt, nämlich über endogenes CCR5-gebundenes a-catenin, erfolgen könnte. Das zweite hier neu identifizierte und charakterisierte CCR5-interagierende Protein ist JM4. Dieses Protein ist in der Datenbank deponiert, bisher konnte jedoch keine biologische Funktion für JM4 gezeigt werden. JM4 ist mit zellulären Membranen assoziiert, hat vier putative Transmembran-Domänen und oligomerisiert. In der Protein-Datenbank wurden Proteine beschrieben, die auf Aminosäureebene Sequenzhomologien von 35 % bis 92 % mit JM4 teilen. Diese JM4-ählichen Proteine sind konserviert in verschiedenen Spezien und putative Vier- Transmembran-Proteine. Wir konnten die übereinstimmende zelluläre Lokalisation und Verteilung von JM4 und nah verwandten Proteinen, wie dem humanen JWA und seinem homologen Protein, dem GTRAP3-18 aus der Ratte, zeigen. JM4, JWA und GTRAP3-18 bilden Homo- und Hetero-oligomere. Es könnte also sein, dass diese Proteine sich auch gegenseitig funktionell ersetzen können. Dies wird zudem dadurch unterstrichen, dass JWA ähnlich effizient wie JM4 mit dem CCR5-Rezeptor assoziierte. GTRAP3-18 bindet an den Glutamat-Transporter EAAC1 und reguliert über diesen die zelluläre Aufnahme von Glutamat, wie in der Gruppe von Prof. Rothstein, Johns Hopkins Medical Institutions, USA, gezeigt wurde. In einer Zusammenarbeit mit dieser Gruppe haben wir kürzlich zeigen können, dass auch JM4, vergleichbar mit GTRAP3-18, die Transporter-vermittelte zelluläre Aufnahme von Glutamat regulieren kann. Basierend auf diesen Ergebnissen zeichnet sich ab, dass JM4, JWA und GTRAP3-18 eine neue Proteinfamilie bilden, deren Mitglieder an der Regulation von Transmembran- Rezeptoren und -Transportern beteiligt sind. Die Zusammenarbeit mit Prof. Rothstein wird fortgesetzt, um die biologische Funktion von JM4 mit der von GTRAP3-18 zu vergleichen. Die Interaktion von JM4 und CCR5 wurde im Hefe Zwei- Hybrid System durch den C-Terminus der beiden Proteine vermittelt. Weitere CCR5-intramolekulare Bindungsstellen des Rezeptors könnten eine Rolle als zusätzliche "docking sites" spielen, wie Versuche mit verschiedenen Deletionsmutanaten gezeigt haben. In weiteren Studien wurde der Effekt von a-catenin und JM4 nach Überexpression auf verschiedene Rezeptorfunktionen, wie Chemokin-induzierte Aktin-Polymerisation, Internalisierung des Rezeptors und CCR5-vermittelte HIV-1 Infektion, getestet. Retroviren anderer Spezien benutzen zur zellulären Infektion transmembrane Aminosäure-Transporter, die Sequenz- und Struktur-homologien mit dem Glutamat-Transporter EAAC1 haben. In einer begonnenen Zusammenarbeit mit Prof. Weiss, University College London, England, wird getestet, ob JM4, JWA und GTRAP3-18 eine generelle Rolle in der Rezeptor-vermittelten Virusinfektion haben.