Neprilysin – ein Schlüsselenzym zur Behandlung der Adipositas

Abstract

Die Peptidase Neprilysin (NEP) ist an vielen biologischen Prozessen beteiligt. Kürzlich wurde von unserer Arbeitsgruppe ein Einfluss des Enzyms auf die Regulation der Nahrungsaufnahme nachgewiesen. Das macht NEP zu einem interessanten Zielmolekül für die Adipositasforschung. Adipositas gilt als eines der größten globalen Gesundheitsprobleme. Pharmakologische Behandlungsmethoden gibt es bislang jedoch nur wenige. Um den Einfluss von NEP auf die Gewichtsentwicklung weiter zu untersuchen, habe ich folgende Forschungsarbeiten durchgeführt: 1\. Zur Etablierung einer neuen Messmethode der NEP-Aktivität wurde das in der Literatur beschriebene Fluoreszenzsubstrat Abz-Gly-Gly-DPhe-Leu-Arg-Arg-Val-EDDnp evaluiert. In murinen Geweben zeigte sich, dass das Substrat von mehreren Enzymen abgebaut wird. Durch schrittweise Veränderungen der Substratstruktur sollten die unerwünschten Reaktionen unterdrückt werden. Mit dem Substrat Abz-Gly-Gly-DPhe-Leu-Agp-Arg-Val-EDDnp gelang dies zum Teil, da noch nicht alle Nebenreaktionen beseitigt wurden. 2\. Um NEP in vivo weiter untersuchen zu können, wurden zwei transgene Mauslinien generiert, die das Enzym gewebespezifisch überexprimieren. Es konnten keine Tiere identifiziert werden, die im Gehirn eine erhöhte NEP-Aktivität aufwiesen, obwohl die DNA für die neuronale NEP-Überexpression im Genom der Tiere integriert war. Die transgenen Tiere mit endothialer Überexpression verstarben hingegen bereits sehr jung oder bekamen keine Nachkommen. 3\. Mehrere Substanzen wurden in vitro auf eine NEP-aktivierende Wirkung untersucht. Eine stimulierende Wirkung des PPARδ-Agonist GW0742 konnte in SK-N -SH-Zellen bestätigt werden. Auch mit einem Pflanzenextrakt (PE) wurde eine Erhöhung der NEP-Aktivität in SK-N-SH-Zellen und BAEC-Zellen gemessen, nicht aber in HDMEC-Zellen. Es konnte keine Fraktion des PE identifiziert werden, die für die Erhöhung der NEP-Aktivität hauptsächlich verantwortlich ist. Weitere potentielle NEP-Aktivatoren, die in einer Hochdurchsatzsuche identifiziert wurden, führten zu sehr unterschiedlichen Ergebnisse in den Zelllinien. 4\. Um zu evaluieren, ob eine Erhöhung der NEP-Aktivität zu einer Gewichtsreduktion führt, wurden Mäuse mit PE behandelt. In fettleibigen Mäusen konnte durch PE eine Gewichtsreduktion durch Verringerung des Körperfettanteils induziert werden. Der Grund war eine reduzierte Nahrungsaufnahme. In den Tieren war die NEP-Aktivität in den peripheren Organen erhöht, im Gehirn jedoch unverändert. In einem zweiten Versuch trat eine verringerte Gewichtszunahme durch PE in jungen, wildtypischen Mäusen, nicht aber in ihren NEP-defizienten Geschwistertieren auf. Damit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass die durch den PE induzierte Gewichtsreduktion durch NEP vermittelt wird, und dass durch eine Aktivierung von NEP eine Reduktion des Körpergewichts erzielt werden kann. Damit eröffnet diese Arbeit neue Möglichkeiten im Kampf gegen eine der am stärksten verbreiteten Volkskrankheiten der Welt, der Adipositas.

The peptidase Neprilysin (NEP) is involved in a variety of biological processes. Recently our group showed the influence of NEP on the regulation of food consumption and body weight. This finding makes NEP an interesting target for the research on obesity. Obesity is known as one of the most serious health concerns with pandemic dimension in recent times. However, the treatment of the disease proofs to be difficult and so far there are only very limited pharmaceutical treatment options available. To investigate the influence of NEP on the development of body weight further, I carried out the following research projects: 1\. To establish a new method for the measurement of NEP-activity, I evaluated the fluorescent substrate Abz-Gly-Gly-DPhe-Leu- Arg-Arg-Val-EDDnp which was described in the literature. In murine tissues several degradation products were detected. To prevent the formation of the undesired degradation products the substrate structure was altered gradually. With the substrate Abz-Gly-Gly-DPhe-Leu-Agp-Arg-Val-EDDnp some progress could be achieved, but not all side reaction were eliminated. 2\. For further in vivo investigation of NEP, two transgenic mouse lines with tissues-specific overexpression of NEP were generated. Animals with DNA integrated in the genome, which should have lead to higher NEP expression in neuronal cells, did not show an increase in NEP-activity in brain samples. Transgenic animals with endothelial overexpression of NEP died in an early age or did not get offspring. 3\. An NEP-activating property of several substances was studied in cell culture experiments. For the PPARδ-Agonist GW0742 a stimulation of NEP was confirmed in SK-N-SH cells. Also with a plant extract (PE) an increase in NEP-activity was detected in SK-N-SH and BAEC cells, but not in HDMEC cells. It was not possible to identify a single fraction of the PE that could be mainly responsible for the increase. A variety of potential NEP-activitors which were identified by high throughput screenings showed very varying results with the used cell lines. 4\. To evaluate if an increase of NEP- activity leads to a reduction of body weight, mice were treated with PE. In an obese mouse model treatment with PE resulted in a reduction of body weight by decreasing the amount of fat. This occurred because of a reduced food intake of the treated mice. Measurement of NEP-activities showed an increase in peripheral organs but no changes of NEP localized in the brain. In a second approach the increase of body weight in young mice was slowed down by PE in wild type animals but not in NEP-deficient litter mates. Therefore in this thesis could be shown for the first time that the PE-induced reduction of body weight is mediated by NEP. Furthermore it was shown that an activation of NEP can be used to reduce bodyweight. The research is opening up new ways to fight one of the most widespread diseases of civilization, obesity.