dc.contributor.author
Leitner, Heidi
dc.date.accessioned
2018-06-07T22:00:27Z
dc.date.available
2012-03-20T09:30:44.216Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8739
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12938
dc.description.abstract
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, das Verhalten von ß-Catenin während der
frühen präimplantatorischen Embryonalentwicklung, insbesondere während des
kritischen 8-Zellstadiums, näher zu analysieren, um Hinweise auf eine mögliche
Funktion von ß-Catenin während dieser Entwicklungsphase zu erhalten. Hierzu
wurden neben der Höhe des Gesamtproteinlevels von ß-Catenin auch dessen
Phosphorylierungsstatus sowie das Verteilungsmuster von Gesamt-ß-Catenin (GBC)
und phosphoryliertem ß-Catenin betrachtet. Dabei lag das Hauptaugenmerk auf
N-PBC (an Ser33/Ser37/Thr41 phosphoryliertes ß-Catenin), dessen Funktion durch
den Einsatz eines GSK3-Inhibitors noch genauer untersucht werden sollte.
Darüber hinaus wurden zusätzlich das Proteinlevel und die Lokalisation von
C-PBC (an Ser552 phosphoryliertes ß-Catenin) betrachtet. FRAP-Analysen von
YFP-markiertem ß-Catenin dienten der Analyse von Translokationsprozessen
innerhalb des Embryos. Auf diese Weise sollte das Wissen bezüglich der
grundlegenden Mechanismen, die während der in diesem Zeitraum stattfindenden
embryonalen Genomaktivierung und der folgenden ersten Differenzierungsprozesse
eine Rolle spielen, verbessert werden. Durch eine Erweiterung des Wissens auf
diesem Gebiet könnte ein Beitrag geleistet werden, langfristig die Technik der
In-vitro-Produktion boviner Embryonen zu verbessern. ß-Catenin war vom 4-bis
zum 16-Zellstadium in konstant hohen Proteinlevels nachweisbar und stammt
somit aus maternaler und embryonaler Genaktivität. In den untersuchten
Entwicklungsstadien war es nur in geringem Maß an Ser33/Ser37/Thr41
phosphoryliert. Allerdings zeigte der gegen N-PBC gerichtete Antikörper im
Westernblot zusätzlich ein deutliches Signal mit NIP, einem noch nicht näher
identifizierten Protein von geringerem Molekulargewicht. Hierbei könnte es
sich um ein phosphoryliertes Splicing-oder Spaltprodukt oder um ein von
ß-Catenin völlig unabhängiges Protein handeln. Da bei der Analyse des
Verteilungsmusters nicht zwischen NIP und N-PBC unterschieden werden konnte,
beziehen sich die diesbezüglichen Angaben auf beide Proteine, die hierfür
unter der Bezeichnung SHEP (Summe homologer Epitope aufweisender
Phosphoproteine) zusammengefasst wurden. C-PBC schien in größeren Mengen
vorhanden zu sein als N-PBC. In den untersuchten bovinen
Präimplantationsembryonen lag GBC überwiegend membranständig vor. Ein
geringerer Anteil befand sich im Zytoplasma, wobei hier eine im
Entwicklungsverlauf zunehmende perinukleäre Verdichtung (Corona) auszumachen
war. In sehr kleinen Mengen war ß-Catenin auch im Zellkern zu finden. Die
durchgeführten FRAP-Analysen zeigten, dass es im Lauf der präimplantatorischen
Embryonalentwicklung zu einer Translokation von zytoplasmatischem ß-Catenin in
den Zellkern kam, was auch in Zusammenhang mit der perinukleären Verdichtung
stehen könnte. Überraschenderweise schienen sich überwiegend die
phosphorylierten Varianten von ß-Catenin, SHEP und C-PBC, im Zell¬kern
anzureichern. Dies widerspricht der am nächsten liegende Vermutung, dass
ß-Catenin unter dem Einfluss von Wnt-Signalen in den Zellkern transloziert, da
in diesem Fall an den Aminosäureresten Ser33, Ser37 und Thr41
hypophosphoryliertes ß-Catenin zu erwarten wäre. Dennoch spricht die Tatsache,
dass die Phosphoproteine offensichtlich im Zellkern akkumulierten und sich
bezüglich ihrer Lokalisation dabei zunehmend auf bestimmte Kernbereiche
konzentrierten (Bildung von nuclear bodies), dafür, dass sowohl SHEP als auch
C-PBC eine physiologische Funktion während der frühesten Embryonalentwicklung
innehaben könnten. Der Einsatz des GSK3-Inhibitors führte nicht zu dem
erwarteten Rückgang des N-PBC-Levels und der damit in Zusammenhang stehenden
Akkumulation von dephosphoryliertem ß-Catenin. Eine derartige Stimulierung des
Wnt-Signalwegs ist aus ähnlichen Versuchen an somatischen Zellen bekannt.
Nichts desto trotz waren unter Inhibitoreinfluss gewisse Effekte sichtbar,
insbesondere, was das Verteilungsmuster von GBC und SHEP betrifft. So kam es
zu einer Verringerung des nukleären SHEP-Levels verbunden mit einem Rückgang
des Anteils von Embryonen mit nuclear bodies und Corona. Dies deutet darauf
hin, dass GSK3 auch bei frühesten Entwicklungsstadien bereits eine
funktionelle, allerdings vom Wnt-Signalweg vermutlich unabhängige Rolle
spielt. Insgesamt deutete sich an, dass es um den Zeitpunkt der embryonalen
Genomaktivierung herum in bovinen Embryonen zu interessanten, jedoch teils
unerwarteten und noch nicht abschließend erklärbaren Phänomenen das Verhalten
von ß-Catenin betreffend kommt. Gleichwohl scheint dieses Protein durchaus
eine Rolle in dieser frühen Entwicklungsphase zu spielen. Um diesbezüglich
genauere Interpretationen zu ermöglichen, sind im Rahmen zukünftiger
Forschungsarbeiten detailliertere Untersuchungen, insbesondere unter
Einbeziehung weiterer Signalkaskaden, nötig.
de
dc.description.abstract
The purpose of this research project was to investigate the characteristics of
ß-catenin during early preimplantation development, especially during the
critical 8-cell stage, in order to get information about a possible function
of ß-catenin during this phase of development. For this, we considered the
protein level of ß-catenin as well as its phosphorylation status and the
distribution pattern of total ß-catenin and phosphorylated ß-catenin. In this
process, the main focus of attention was on N-PBC (ß-catenin phosphorylated at
Ser33/Ser37/Thr41), whose function should be analysed more deeply by using a
GSK3-inhibitor. In addition, the protein level and localization of C-PBC
(ß-catenin phosphorylated at Ser552) was considered. To investigate processes
of translocation of ß-catenin within the embryo, FRAP-analyses of YFP-tagged
ß-catenin were performed. Thereby, the knowledge about basic machanisms that
are important during embryonic genome activation and the following first
processes of differentiation should be improved. By augmenting the knowledge
within this sector, it could be possible to make a contribution to an
improvement of in-vitro-production of bovine embryos in the long run. Non-
varying protein levels of ß-catenin were detectable from the 4- to the 16-cell
stage. Thus ß-catenin was both of maternal and embryonic origin. In embryos of
the investigated developmental stages, it was phosphorylated at
Ser33/Ser37/Thr41 only to a minor degree. However, in the Western blot, the
anti-N-PBC antibody additionally showed a clear reaction with NIP, a still
unidentified protein of lower molecular weight. This protein might be a
phosphorylated cleavage-or splicing-product or another protein that is
completely independent of ß-catenin. Concerning the analysis of the
distribution pattern, it was not possible to distinguish between NIP and
N-PBC. Thus, the statements made in this regard refer to both proteins.
Therefore, we introduced the term SHEP that includes both NIP and N-PBC. C-PBC
seemed to be detec¬table in higher quantities than N-PBC. Within the
invastigated preimplantation embryos, ß-catenin was localized mainly at the
cell membrane. A lesser fraction was found in the cytoplasm, where an
increasing perinuclear aggregation (corona) could be observed in the course of
development. Diminutive amounts of ß-catenin could also be detected in the
nucleus. The FRAP-analyses showed a translocation of ß-catenin from the
cytoplasm to the nucleus in the course of preimplantation development, which
could be associated with its perinuclear aggregation. Surprisingly, mainly the
phosphorylated forms of ß-catenin, SHEP and C-PBC, seemed to accumulate in the
nucleus. This is contrary to the most obvious assumption that ß-catenin is
translocated into the nucleus in the context of wnt-signaling, as in this
case, ß-catenin that is hypophosphorylated at Ser33, Ser37 and Thr 41 would be
expected. Nevertheless, the fact that the phosphoproteins apparently
accumulate in the nucleus and thereby concentrate their localization on
specific nuclear regions (formation of nuclear bodies) indicates that both
SHEP and C-PBC could play a physiological role in the nucleus during earliest
embryonic development. The application of the GSK3-inhibitor has not led to
the expected decline of the protein level of N-PBC and to the associated
accumulation of dephosphorylated ß-catenin. Such a stimulation of the wnt-
signaling pathway is known from comparable experiments with somatic cells.
Nevertheless, under the influence of the inhibitor, certain effects could be
seen, especially concerning the distribution pattern of total ß-catenin and
SHEP. This implies a diminished level of nuclear SHEP as well as a reduced
proportion of embryos with nuclear bodies or a corona. This suggests that,
also in embryos of early developmental stages, GSK3 already plays a functional
part, that, however, probably is independent of the wnt-signaling pathway. All
in all, it seems that around the time of embryonic genome activation,
interesting, but partly unexpected and not completely explainable phenomena
concerning the properties of ß-catenin are taking place in bovine embryos.
Nevertheless, this protein seems to have a function in this early phase of
development. To enable more precise interpretations in this regard, more
detailed investigations, especially the consideration of further signaling
cascades, would be necessary.
en
dc.format.extent
VIII, 136 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
embryonic development
dc.subject
preimplantation period
dc.subject
transactivation
dc.subject
gene expression
dc.subject
in vitro production
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Phosphorylierungsstatus und Verteilungsmuster von β-Catenin in bovinen
Embryonen um den Zeitpunkt der Aktivierung des embryonalen Genoms
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Dr. Ralf Einspanier
dc.contributor.furtherReferee
Univ.-Prof. Dr. Johanna Plendl
dc.contributor.furtherReferee
PD Dr. Joachim Weitzel
dc.date.accepted
2012-01-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000036411-4
dc.title.translated
Phosphorylation status and distribution pattern of β-catenin in bovine embryos
around the time of embryonic genome activation
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000036411
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010805
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access