Das Rcs-System und die RcsAB-Box: Identifikation eines neuen, essentiellen Operators für die Regulation der enterobakteriellen Kapselbiosynthese

Abstract

Die Fähigkeit zur Ausbildung von Kapseln ist unter Bakterien sehr weit verbreitet. Diese Kapseln bestehen aus langkettigen, modular aufgebauten Polysacchariden und stellen die Schnittstelle für die Interaktion des Bakteriums mit seiner Umwelt dar. Bei pathogenen Organismen dient das EPS (Exopolysaccharid) dem Schutz vor Wirts-Abwehrmechnismen und ist gleichzeitig ein zentraler Virulenzfaktor. Die Enterobakterien Escherichia coli, Erwinia amylovora und Pantoea stewartii subsp. stewartii bilden die EPS Colansäure, Amylovoran und Stewartan. Alle diese Kapseln gehören zur Gruppe IA der bakteriellen Polyasccharide. Die Kapsel-Biosynthesegene sind in Operon-artigen Genclustern organisiert (den wza- ams- und cps-Clustern) und werden vom Rcs- System (regulation of capsule synthesis), mit den drei Kernproteinen RcsA, dem durch Phosphorylierung in seiner Aktivität modulierbaren RcsB und RcsC, einem membranständigen Sensorprotein mit Kinaseaktivität, reguliert. Zur Aktivierung der Transkription bindet ein RcsA/RcsB-Heterodimer (RcsAB) an die jeweiligen Promotorsequenzen und initiiert so die mRNA-Synthese. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die RcsAB/DNA-Interaktion näher zu charakterisieren. Die apparente Gleichgewichtskonstante KD des RcsAB/ams-Promotor-Komplexes konnte mit Hilfe von Bandshift-Experimenten zu 100 nM, die des RcsAB/wca-Promotors durch Einsatz der Surface Plasmon Resonance (SPR) Technik zu 77 nM bestimmt werden. Durch eine in-vitro-Selektion des ams-Promotors konnte eine erste Konsensussequenz der RcsAB-Bindung formuliert werden (Wehland et al., 1999), die es ermöglichte, durch Datenbankrecherche und EMSA-Bindungsstudien insgesamt 13 RcsAB-Bindungsstellen sowohl in den EPS- und rcsA-Promotoren von E. coli, E. amylovora, P. stewartii, Salmonella typhi und Klebsiella pneumoniae K2, also auch in den bvgA\- und fha-Promotoren von Bordetella pertussis und B. parapertussis zu identifizieren. Durch die Zusammenstellung aller Sequenzen war es möglich, ein allgemeines RcsAB-Bindungsmotiv, TaAGaatatTCctA, die in dieser Arbeit so benannte RcsAB-Box zu formulieren (Wehland et al., 2000). Die essentielle Rolle der RcsAB-Box bei der EPS- Regulation konnte durch in-vivo-Experimente bestätigt werden. Neben den RcsAB- Bindungsstellen in den jeweiligen Hauptpromotoren wurden außerdem in den ams\- und wca-Operons interne, schwächere Bindungsstellen gefunden, deren biologische Bedeutung aber noch nicht geklärt ist. Die RcsAB-Bindung an rcsA- Promotoren wurde erstmals gezeigt. In-vitro Bindungsassays und in-vivo- Experimente bekräftigten übereinstimmend die zentrale Rolle der RcsAB-Box. Eine Mutation des RcsB-Proteins (RcsB(11D-A)) in seinem Phosphorylierungsmotiv führte zu konstitutiver, RcsA-unabhängiger EPS-Synthese in E. coli. SPR- Analysen ergaben, daß RcsB(11D-A) gegenüber dem Wildtyp-Protein eine zehnfach erhöhte DNA-Affinität besitzt und durch Phosphorylierung nicht deaktiviert werden kann. SPR- und in-vivo-Studien zeigten auch hier, daß die Abwesenheit einer RcsAB-Box die RcsB/DNA-Interaktion komplett beseitigte. Im Rahmen dieser Untersuchungen gelang außerdem mittels SPR-Messungen erstmals der Nachweis einer RcsA/RcsB-Interaktion in Lösung.

The ability to form capsules is a widespread feature between various bacterial species. The capsules consist of long, modular polysaccharides and represent the interface for the interaction of the bacteria with their environment. Furthermore, the exopolysaccharide (EPS) of pathogenic organisms serves as a protection against host-defense mechanisms and is also an important virulence determinant. The enterobacteria Escherichia coli, Erwinia amylovora, and Pantoea stewartii subsp. stewartii synthesize the EPS colanic acid, amylovoran, and stewartan, respectively. All these capsules belong to the group IA of bacterial polysaccharides. Their biosynthetic genes are organized in operon-like clusters (the wca-, ams-, and cps-cluster) and are regulated by the Rcs (regulation of capsule synthesis) system, consisting of the three proteins RcsA, RcsB, whose activity can be modulated by phosphorylation, and RcsC, a membrane located sensor kinase. Activation of transcription is achieved by binding of an RcsA/RcsB heterodimer (RcsAB) to suitable promoter sequences. In this work, the RcsAB/DNA interaction was further characterized. The apparent equilibrium constant KD = 100 nM of the RcsAB/ams-promoter complex has been determined using the bandshift technique, while the KD = 77 nM of the RcsAB/wza-promoter complex was calculated using the surface plasmon resonance (SPR) technique. An in vitro selection of the ams-promoter made it possible to formulate a first consensus motif for RcsAB binding (Wehland et al., .1999), which allowed to find 13 more RcsAB binding sites in the EPS- and rcsA\- promoters from E. coli, Ew. amylovora, P. stewartii, Salmonella typhi, and Klebsiella pneumoniae as well as in the bvgA\- and fha-promoters from Bordetella pertussis and B. parapertussis by data bank search. A compilation of these sequences resulted in the finding of a common RcsAB binding motif, the RcsAB box : TaAGaatatTCctA (Wehland et al., 2000). The essential role of the RcsAB box in EPS regulation was additionally confirmed by in vivo experiments Besides the RcsAB binding sites in the EPS main promoters, internal, weaker binding sites inside the ams\- and wca-operons were identified, but their biological function remained unclear. The RcsAB binding to various rcsA promoters has been shown for the first time. In vitro and in vivo experiments confirmed the central role of the RcsAB box for RcsAB/DNA interaction. Expression of an RcsB protein bearing a mutation in its phophorylation motif (RcsB(11D-A)) led to constitutive, RcsA independent EPS synthesis in E. coli. SPR analyses showed a tenfold increased DNA affinity of RcsB(11D-A) compared to the wildtype protein, which cannot be suppressed by phosphorylation. Furthermore, SPR and in vivo studies provided evidence for the involvement of the RcsAB box in RcsB/DNA interaction as a deletion of the RcsAB box abolished RcsB binding completely. Additionally, the first experimental proof together with the kinetic data for an RcsA/RcsB interaction in solution is presented.