Investigation of the binary protein-protein interactions of the yeast and the human nuclear pore complex

Abstract

To systematically elucidate how cellular processes are carried out it is necessary to gain insight into how proteins are organized into protein complexes. One such complex represents one of the largest protein assemblies in the cell called the Nuclear Pore Complex (NPC). The NPC consists of multiple copies of around 30 distinct proteins called Nucleoporins (Nups) that are grouped into subcomplexes whereas the largest, the Y-complex is suggested to be the structural given subcomplex. To emerge insight into the NPC subcomplex organization we utilized a high-throughput Y2H screen to determine binary protein-protein interactions (PPI). Besides yeast full length constructs the Y2H screen included fragments of yeast nucleoporins (nups) and several construct of human full length nups resulting in a network comprising 44 PPIs between 26 yeast nups and 16 PPIs between 15 human nups. The Y2H screen revealed direct connections within and between all subcomplexes of the yeast and the human NPC even on fragment level. While benchmarking the yeast Y2H data against previous published binary data set we confirmed highly reliable data. We validated selected inter and intra Y-complex PPIs with cell- based and biophysical experiments (protein-complementation assay for the human PPIs and MST for the yeast PPIs). The obtained PPI data were used to analyze the previous models based on Y-complex arrangement. We could fit our data in the latest model which arranges eight Y-complexes in an overlapping head-to- tail orientation whereas the Y-complexes are positioned in a 55° angle to the nuclear envelope, though many uncertainties remain, in particular steric constraints may arise that could exclude proposed interactions in the suggested arrangements. However, our validated inter Y-complex interactions allow the conclusion that more than two relative Y-complex positions within the NPC must exist. Taken together the Y2H data will assist further structural work on subcomplex organization.

Um Einblick in zelluläre Prozesse zu bekommen, ist es wichtig, die Organisation von Proteinkomplexen zu verstehen. Ein solcher Proteinkomplex ist der Kernporenkomplex (Nuclear Pore Complex – NPC). Es ist der größte Proteinkomplex der Zelle bestehens aus multiplen Kopien von ca. 30 Proteinen, den Nucleoporinen. Diese sind in Subkomplexe gruppiert. Der größte, strukturgebende Subkomplex ist der Y-Komplex. Um die Subkomplexorganisation des NPCs zu verstehen, wurde ein Hochdurchsatz-Hefe-2-Hybrid-Experiment durchgeführt, in dem neben vollständigen Konstrukten auch Fragmentkonstrukte von humanen sowie auch Hefenucleoporinen verwendet wurden. Das Experiment resultierte in Netzwerken bestehend aus 44 Protein-Proteininteraktionen (PPIs) zwischen 26 Hefeproteinen und 16 PPIs zwischen 15 humanen Nucleoporinen. Beim Vergleich des Hefenetzwerkes mit schon publizierten Daten konnten wir einen sehr verlässlichen Datensatz bestätigen. Zusätzlich wurden ausgewählte inter- und intra Y-Komplexinteraktionen mit zellbasierten und biophysikalischen Experimenten validiert (Protein-Komplementationsexperiment bei humanen PPIs und Microscale-Thermophorese bei den PPIs). Die resultierenden PPIs wurden genutzt um bestehende Modelle der NPC-Organisation auf der Basis des Y-Komplexes zu analysieren. Unsere Daten passten am besten zu dem Modell, dass acht Y-Komplexe in einer überlappenden Kopf-zu-Schwanz Anordnung orientiert, wobei die Y-Komplexe in einem 55° Winkel zur Kernmembran angeordnet sind. Es verbleiben jedoch Unsicherheiten, insbesondere sterische Beschränkungen, die die vorgeschlagenen Wechselwirkungen in den speziellen Anordnungen ausschließen. Dennoch erlauben unsere Daten die Schlussfolgerung, dass mehr als zwei relative Y-Komplex-Anordnungen innerhalb eines NPCs existieren. Zusammenfassend werden die erhaltenen Daten bei zukünftiger struktureller Arbeit an der Subkomplexorganisation des NPCs helfen.