Gezielte Attenuierung und Markierung von Viren der klassischen Schweinepest durch Mutation: Ansätze zur Entwicklung einer neuartigen Vakzine gegen das Virus der klassischen Schweinepest zur Differenzierung infizierter von vakzinierten Tieren

Abstract

Die klassische Schweinepest ist eine in Deutschland anzeigepflichtige, hoch kontagiöse Erkrankung der Haus- und Wildschweine, die mit hohen Tierverlusten einhergehen kann und eine große wirtschaftliche Bedeutung besitzt. Die Bekämpfung der Krankheit ist in Deutschland durch die Schweinepest-Verordnung geregelt, deren zentraler Punkt ein generelles Impfverbot ist. Eine Ausnahme hiervon stellen lediglich behördlich angeordnete Notimpfungen im Falle eines festgestellten Seuchenausbruchs dar. Diese Politik ist auch darin begründet, dass es gegenwärtig keine kommerziell verfügbaren DIVA ("Differentiation between Infected and Vaccinated Animals") Vakzinen gegen das Virus der klassischen Schweinepest (classical swine fever virus, CSFV) gibt, die die optimale Schutzwirkung einer rekombinanten Lebendvakzine mit einem zuverlässigen Markierungsprinzip im Sinne des DIVA-Kriteriums in sich vereinen. Das zentrale Thema dieser Arbeit war daher die Identifizierung und Charakterisierung einer CSFV (Classical Swine Fever Virus) Mutante, die die hohen Anforderungen an eine neuartige CSFV DIVA-Vakzine erfüllen kann. Als Grundlage für eine solche Mutante wurde eine CSFV-Doppeldeletionsmutante getestet, die die attenuierenden Mutationen einer Deletion des für das Nichtstrukturprotein „Npro“ (N-terminale Protease) kodierenden Genombereichs und einer Ausschaltung der RNase-Aktivität des Strukturproteins „Erns“ (“envelope protein ribonuclease secreted”) in sich vereint. In einem Tierexperiment mit tragenden Sauen konnte gezeigt werden, dass diese Mutante im adulten Tier völlig apathogen ist, die Bildung von CSFV-spezifischen neutralisierenden Antikörpern induziert und keine Etablierung von diaplazentaren persistenten Infektionen in den Feten stattfindet. In einem nächsten Schritt gelang es, diese CSFV-Doppeldeletionsmutante mit einer Negativmarkierung im Sinne des DIVA-Kriteriums zu kombinieren. Als Angriffspunkt hierfür wurde das hoch konservierte, CSFV spezifische Epitop TAVSPTTLRT (TAV-Epitop) im Strukturprotein „E2“ („envelope protein 2“) von CSFV gewählt. Es war möglich, verschiedene TAV-Epitop markierte CSF- Virusmutanten zu generieren, die sich im Sinne des DIVA-Kriteriums funktional und in der Tierpassage stabil erwiesen. Die TAV-Epitop Markierung führte allein nicht zu einer Attenuierung der Viren, ließ sich jedoch stabil mit attenuierenden Mutationen (Npro-Deletion und Auschaltung der Erns-RNase) kombinieren. Eine TAV-Epitop markierte Doppelmutante konnte als vielversprechender Kandidat für eine neuartige CSFV DIVA-Vakzine identifiziert werden. Für die Impfstoffentwicklung ist die Aufklärung von molekularen Mechanismen essentiell, die für die Virulenz der Erreger von Bedeutung sind. Die Dimerisierung des Strukturproteins „Erns“ ist als Virulenzfaktor von Pestiviren in diesem Zusammenhang ein spannendes Thema. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden daher aufbauend auf die Ergebnisse vorangegangener Arbeiten Experimente mit dimerisierungsnegativen CSFV-Mutanten durchgeführt. In diesen Mutanten war zum einen die Dimerisierung des Erns-Proteins an Position Cystein 171 durch Deletion oder Mutation des Cysteins verhindert, und zum anderen wurde den Viren an der alternativen Position 209 im Erns-Protein die Möglichkeit zur Restaurierung der Dimerisierung durch eine Cystein- Substitution gegeben. Diese Versuche ergaben neue Hinweise darauf, dass die Fähigkeit zur Erns-Dimerisierung einen Virulenzfaktor von Pestiviren darstellt. Abgesehen von individuellen Schwankungen bei einzelnen Tieren ergab sich jedoch im Tierversuch ein heterogenes Bild, sodass die Experimente als Grundlage für weitere Untersuchungen zu diesem interessanten Thema zu sehen sind.

Classical swine fever is a highly contagious viral disease of swine and wild boar that leads to important economic losses. In Germany the abatement of the disease is regulated via a national decree, the so called "Schweinepest- Verordnung". This decree constitutes a general ban of vaccination against classical swine fever. In case of an outbreak of classical swine fever emergency vaccination can be performed but only upon official approval of the authority. This control policy is at least partially based on the fact that there are currently no commercial vaccines available that combine the optimized protective qualities of an attenuated live vaccine with a functional labelling concept to differentiate infected from vaccinated animals. Therefore, the essential topic of this work was the identification and characterization of a promising classical swine fever virus (CSFV) mutant that could possibly serve as candidate for a novel classical swine fever virus DIVA (Differentiation between Infected and Vaccinated Animals) vaccine. As backbone for such a candidate we tested a CSFV double deletion mutant that combines two attenuating mutations: the deletion of the non-structural protein “Npro” coding region of the genome and the abrogation of the structural protein “Erns” (“envelope protein RNase secreted”) RNase acitivity. In an animal trial employing pregnant sows we were able to show that the classical swine fever virus double deletion mutant proved completely apathogenic for adult animals, that it was able to induce significant titres of classical swine fever virus specific neutralizing antibodies and that it was unable to establish persistent infection in the fetuses. In a next step, we established a negative labelling strategy using the highly conserved B-cell epitope TAVSPTTLRT (“TAV- epitope”) contained in the structural protein “E2” (“envelope protein 2”) of classical swine fever virus. We found out that the TAV-epitope mutations alone didn´t lead to an attenuated phenotype of the virus in the natural host, but remained stable and functional via animal passage. Furthermore, it proved possible to combine the TAV-epitope labelling with known attenuating mutations such as the above described double deletion. In conclusion, the TAV-epitope labelled CSFV double deletion mutant constitutes a promising candidate for a future DIVA live vaccine against classical swine fever. For the development of novel vaccines, knowledge of the molecular mechanisms underlying pathogen virulence is of great importance. In this context, structural protein “Erns” dimer formation as virulence factor of pestiviruses is a fascinating topic. In an animal experiment two different mutants in which the ability to generate “Erns” dimers was abrogated via mutation or deletion of cysteine 171 were tested. In addition, these variants were able to form “Erns” dimers via a newly introduced cystein codon at position 209. The finding of this experiment indicated that the location of “Erns” dimers is indeed linked to CSFV virulence. Since however variations were observed in this experiment for individual animals, the findings of this experiment were heterologous and have to be regarded as basis for future research in the matter of “Erns” dimerization.