Suche, Reinigung und Identifizierung von Urotensin-II generierenden Enzymen

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, Urotensin-II-(UII)-generierende Enzyme in Extrakten aus Schweinenieren aufzuspüren, zu reinigen, und zu identifizieren. Zur Entwicklung der Reinigungsschritte ist ein chromatographisches System (PPS- System) zur schnellen Bestimmung optimaler chromatographischer Parameter für diese Arbeit entwickelt worden. Für den Nachweis der UII-generierenden Aktivität wurde das Massenspektrometrie-basierte Enzym-Screening-System (MES- System) genutzt. Mit der Kombination dieser beiden neuen Systeme ist es gelungen, weitgehend homogene Fraktionen mit UII-generierender Aktivität aus Nierengewebe zu gewinnen. In einer dieser Fraktionen konnte ein Enzym durch die MALDI-Fingerprint Analyse als "Pregnancy-Associated-Glycoprotein" (PAG2) identifiziert werden. In einer zweiten Fraktion mit UII-generierender Aktivität wurde mit der LC-ESI MS/MS Analyse eine Dislufid-Isomerase-A3 identifiziert. PAG2 zeigt im Bereich seines katalytischen Zentrums eine Sequenzhomologie mit Pepsin. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Pepsin- Präparation, gewonnen aus dem Magen des Schweins, UII generiert. Daher ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass PAG2 für die Generierung von UII verantwortlich ist. Da die Disulfid-Isomerase-A3 durch eine einfache Punktmutation eine Serin-Protease-Aktivität zeigt und die gereinigte UII-generierende Fraktion durch Aprotinin, einem Serin-Protease-Inhibitor, gehemmt werden konnte, ist auch in diesem Fall die Wahrscheinlichkeit hoch, dass ein Enzym, das eine hohe Sequenzübereinstimmung mit der Disulfid-Isomerase-A3 hat, UII generiert. Inwieweit die identifizierten Enzyme die Schlüsselenzyme für die UII- Generierung darstellen, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Es konnte zum ersten mal gezeigt werden, dass UII möglicherweise über die Peptide KPYKKR-UII und KR-UII aus dem Precursor generiert wird, vergleichbar der Generierung von Angiotensin-II über Angiotensin-I aus Angiotensinogen.

In dieser Arbeit ist es nicht nur gelungen, PAG2, die Disulfid-Isomerase-A3 und Pepsin A als UII-generierende-Proteasen zu identifizieren sondern es konnte auch gezeigt werden, dass UII über mehrere Urotensin-Peptidvorstufen generiert werden kann.

It was the aim of this work to purify and identify urotensin- II-(UII)-converting enzymes from porcine renal tissue. For this purpose, two systems, the mass-spectrometry-assisted enzyme-screening (MES) and the protein-purification-parameter-system (PPS), were developed and used. MES was used for the detection of UII-generating activity. With PPS parameters for the optimized chromatographic purification of a target protein can be estimated very fast. By applying the MES and the PPS systems nearly homogenous porcine kidney fractions with UII-generating activity were yielded. With the MALDI fingerprint method the pregnancy-associated-glycoprotein (PAG2), and with the LC-ESI MS/MS strategy the disulfide-isomerase-A3 were identified in two different fractions. The catalytic domain of PAG2 is identical with that of pepsin. Since the incubation of the urotensin substrate with pepsin from porcine stomach generates UII as the PAG2 containing fraction, it is likely, that PAG2 is responsible for the UII formation. The disulfide-isomerase-A3 can be easily converted in a serine protease by a simple point mutation. Because the UII-generating fraction was inhibited by aprotinin, a serine protease inhibitor, the propability is high, that an enzyme with a high homology towards the disulfide-isomerase-A3 has an UII-generating activity.

Furthermore, in this work was demonstrated for the first time, that UII may be generated via larger peptides, KPYKKR-UII and KR-UII from its precursor, comparable to angiotensin-II, which is generated from angiotensinogen via angiotensin-I. Future work must prove, if PAG2 and the disulfide-isomerase-A3 are physiologically relevant for the UII-generation.

In conclusion, PAG2, the disulfide-isomerase-A3 and pepsin A were identified, which are able to generate UII. It was shown that UII can be generated stepwise via several precursor-peptides.