Circulating Tumor Cells as Indicators of Metastatic Spread of Canine Mammary Tumors

Abstract

In breast cancer CTC have been subject of much attention in the past years. CTC and their detection have proven clinical usefulness in many types of cancers. In fact through CTC enumeration lower CTC counts were correlated with better disease-free and overall survivals in patients with breast cancer, before and after treatment, hence providing valuable information in terms of prognosis and response to treatment (Cristofanilli, 2006; Hayes et al., 2006; Mostert et al., 2009). Based on in these findings it was hypothesized that CTC are also present in dogs baring metastatic mammary tumors (MT), their detection using nucleic-acid based methods is possible and may correlate with the histological evidence of vascular invasion by tumor cells in the vicinity of the primary tumor. The first phase of the project consisted in the identification of potential canine specific MT CTC mRNA markers. To this end a total of 106 genes identified by three different approaches were tested for their sensitivity and specificity: (1). mRNA markers with proved usefulness for CTC detection of breast cancer CTC; (2). genes known to be overexpressed in CMT; (3). genes identified by microarray technology. These genes were then tested for their expression in the peripheral blood (PB) samples of healthy dog donors (n=12 to 14), metastatic mammary gland carcinomas (n=10) and malignant CMT cell lines (n=2) by RTPCR. To be considered a potential CTC marker, the markers had to follow the selection criterion of not being expressed in the PB and to be expressed in metastatic carcinomas and malignant cells lines. A total of 12 potential candidate mRNA markers were identified. Furthermore the ability of these candidate mRNA markers to detect single tumor cells was tested in serial dilutions of tumor cells from cell lines CMM 26 and CMM115 in the PB were executed. Based on the frequency of occurrence of CTC in humans (1 CTC per 105 to 107 peripheral blood leukocytes (PBL)) a target sensitivity of 1 tumor cell per 106 to 107 PBL was established. From all the candidates only maspin was not able to achieve the desired sensitivity. In a second phase a panel of seven of the previously identified markers were tested in 120 PB samples from female dogs with malignant mammary gland carcinomas with histological evidence of vascular invasion of tumors cells near the primary tumor or presence of metastatic cells in the regional lymph node (n=40), with malignant mammary gland carcinomas without histological evidence of vascular invasion and metastasis free lymph nodes (n=40) and patients with benign mammary gland adenomas (n=40), in order to correlate their expression with the existence of histological evidence of vascular invasion and therefore with the presence of tumor cells in vascular compartments. From the panel of seven markers tested CRYAB was the most promising marker revealing the best relation sensitivity/specificity. Through the establishment of multimarker assays combining the detection abilities of individual markers (CLDN7, CRYAB, ATP8B1 and EGFR) we were able to significantly increase the sensitivity. From all the multimarker patterns MM1 was the best displayed with the best sensitivity/specificity relation. Although multimarker assays significantly enhance the sensitivity of the assay, a moderate loss of specificity is observed, however the multimarker approach seems to be more advantageous the single marker approach. The assays ability to differentiate blood from dogs with malignant tumors with and without vascular invasion with tumor cells, suggest that they may allow the identification of dogs with CTC in the PB, nevertheless further studies that include a follow-up period of 24 month with regular physical examinations and imaging scans are required to determine the real prognostic significance of these CTC markers in the dog.

Zirkulierende Tumorzellen (CTC) waren in den letzten Jahre vermehrt Gegenstand wissenschaftlicher Untersuchungen in der Brustkrebsforschung. So konnte bei Brustkrebspatientinnen gezeigt werden, dass niedrige CTC-Zahlen im Blut mit einem längerem Überleben korrelieren (Cristofanilli, 2006; Hayes et al., 2006; Mostert et al., 2009). Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden für die vorliegende Arbeit folgende Hypothesen aufgestellt: (1). CTC treten auch bei Hunden mit metastasierenden Mammatumoren (MT) auf, (2). ihr Nachweis ist mit Nukleinsäure-basierten Verfahren möglich und (3). der Nachweis von CTC korreliert mit dem histologischen Nachweis von Gefäßeinbrüchen von Tumorzellen inder Nähe des Primärtumors korreliert ist. Die erste Phase des Projekts umfasst die Identifizierung potenzieller, hundespezifischer MT CTC mRNA- Marker. Zu diesem Zweck wurden insgesamt zahlreiche Gene getestet, die durch drei Ansätze identifiziert wurden: (1) mRNA-Marker mit nachgewiesener Eignung zur Erkennung von Brustkrebs CTC; (2) Gene mit bekannter Überexpression in CMT und (3) Gene, die durch Microarray-Technologie identifiziert wurden. Diese Gene wurden dann durch RT-PCR auf ihre Expression im peripheren Blut (PB) gesunder Hunde (n=12 bis 14), Hunden mit metastasierenden Mammakarzinomen (n=10) und malignen CMT-Zelllinien (n=2) getestet. Um als potenzieller CTC Marker zu gelten, sollten die Marker nicht im PB, jedoch immer in metastatischen Karzinomen und MT-Zelllinien exprimiert werden. Insgesamt wurden 12 potentielle mRNA-Marker selektiert. Diese wurden anschließend auf ihre Sensitivität zum Nachweis von CTC in Verdünnungsreihen von Tumorzellen aus zwei Zelllinien im PB getestet. Dabei wurde eine Empfindlichkeit von 1 Tumorzelle pro 106 bis 107 Leukozyten angestrebt. Von allen Kandidaten konnte nur Maspin nicht die gewünschte Sensitivität erreichen. In einer zweiten Phase der Untersuchungen wurden sieben der identifizierten Marker in 120 Blutproben von Hündinnen mit Mammakarzinomen mit histologischem Nachweis metastasierenden Verhaltens (n=40), Hündinnen mit Mammakarzinomen ohne histologischen Nachweis metastasierenden Verhaltens (n=40) und Hündinnen mit Adenomen der Milchdrüse (n=40) getestet Dabei zeigte sich CRYAB als der sensitivste Marker für kanine CTC. Weiterhin zeigte CRYAB das beste Verhältnis von Sensitivität zu Spezifität des Nachweises von CTC. Eine verbesserte Kombination aus Sensitivität und Spezifität konnte jedoch durch die Etablierung eines Multimarker aus 4 Genen, CLDN7, CRYAB, ATP8B1 und EGFR erreicht werden. Nichtsdestotrotz führte die höhere Sensitivität des Multimarkers zu einem moderaten Verlust an Spezifität im Vergleich zum Einzelmarker CRYAB. Die statistischen signifikanten Unterschiede in der Häufigkeit der Expression der Marker in Blut von Hunden mit und ohne malignen Mammatumoren zeigen, dass CTC auch beim Hund wichtige Information zu Therapieerfolgen und Prognose von kaninen Mammatumoren beitragen können. Dennoch sind in Zukunft weitere prospektive klinische Studien nötig, um die prognostische Signifikanz dieser CTC Marker beim Hund sicherzustellen.