Rolle von nukleären Rezeptoren als potentielles Target zur Therapie und Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen

Abstract

Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen in der westlichen Welt die häufigste Todesursache dar. Eine Vielzahl von Studien hat gezeigt, dass die Inflammation eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung von Arteriosklerose und deren Folgeerkrankungen spielt. Proliferation und Migration glatter Gefäßmuskelzellen spielt dabei eine zentrale Rolle sowohl in der Pathogenese arteriosklerotischer Gefäßwandveränderungen als auch der Entstehung von Restenose nach interventionellen Eingriffen. Ein besseres Verständnis der zugrundeliegenden zellulären und molekularen Mechanismen ist die Voraussetzung zur Entwicklung neuer pharmakologischer Strategien zur Prävention und Therapie von Arteriosklerose und Restenose. In der Originalarbeit 1 konnte gezeigt werden, dass Langzeitinkubation glatter Gefässmuskelzellen mit Angiotensin II die PDGF-BB gerichtete Zellmigration erhöht. Die Expression von Zellmigration vermittelnder Integrine blieb dabei unverändert. Allerdings zeigte sich nach Langzeitstimulation mit Angiotensin II eine verstärkte Expression und Phosphorylierung von ERK1/2 MAPK und Pyk2. Weiter konnten wir eine Translokation von Pyk2 von der Plasmamembran in das Zytosol und eine perinukleäre Anreicherung von ERK1/2 MAPK nachweisen. Dies stellt wahrscheinlich den entscheidenden Mechanismus für die durch Angiotensin II Vorbehandlung vermittelte Zunahme der Zellmigration dar und liefert eine weitere molekulare Erklärung für die pro-arteriosklerotische Wirkung von Angiotensin. Der Effekt von Hypoxie auf die Interaktion von VSMCs mit extrazellulären Matrixproteinen wurde in der Originalarbeit 2 untersucht. Dabei zeigte sich, dass Hypoxie durch eine Konformationsänderung des β1 Integrins die Adhäsion an extrazelluläre Matrixproteine verstärkt. Vermittelt wurde die gesteigerte Adhäsion über eine Aktivierung der intrazellulären Signaltransduktionswege ERK1/2 MAPK und p38 MAPK. Diese Daten zeigen erstmalig, dass Hypoxie bei gleichbleibender Expression über eine Konformationsänderung des β1-Integrins Zell-Matrix-Interaktionen moduliert und so eine wichtige Rolle bei vaskulären Umbauprozessen spielt. In der Originalarbeit 3 konnte gezeigt werden, dass das akute Phase Protein CRP Apoptose in glatten Gefässmuskelzellen induziert. Mittels DNA Mikroarray Analysen wurde GADD153 als CRP reguliertes Gen in VSMCs identifiziert. Durch einen spezifischen Knockdown von GADD153 mittels siRNA konnte gezeigt werden, dass die CRP induzierte Apoptose durch GADD153 vermittelt wird. Die Kolokalisation von CRP, GADD153 und apoptotischen VSMCs in arteriosklerotischen Plaques humaner Koronargefäße unterstreicht die funktionelle Rolle von GADD153 in der CRP induzierten Apoptose. Die Rolle des nukleären Rezeptors LXR in der Zellzyklusregulation von VSMCs wurde in der Originalarbeit 4 untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass LXRα und LXRβ in VSMCs exprimiert wird und die Expression des Rezeptors durch synthetische Liganden im Rahmen eines Autoregulationsmechanismus induziert wird. Weiter konnte gezeigt werden, dass eine Aktivierung von LXR mittels synthetischer Liganden die Mitogen-induzierte Zellproliferation und Zellzyklusprogression hemmt. Vermittelt wurde dieser Effekt über eine Hemmung des Abbaus des Zellzyklusinhibitors p27Kip1. Es konnte gezeigt werden, dass LXR Liganden die Expression von Skp2, einem zentralen Bestandteil der SCFSkp2/Cks1-Ubiquitin Ligase, inhibieren und so den proteasomalen Abbau von p27Kip1 verhindern. Die Bedeutung einer LXR Aktivierung mittels spezifischer Liganden wurde in vivo in einem Ballonverletzungsmodell der A. carotis der Ratte untersucht. Dabei zeigte sich eine signifikante Inhibierung der Neointima Formation nach Ballonverletzung bei den mit LXR Liganden behandelten Tieren. Die bis dato unbekannte Rolle von LXRs in der Zellzyklusregulation von VSMCs stellt einen vielversprechenden neuen Therapieansatz zur Prävention und Therapie von vaskulären Umbauprozessen im Rahmen der Arteriosklerose und Restenose dar. Inflammatorische Prozesse spielen in der Frühphase nach Gefäßverletzung eine wichtige Rolle bei der Neointimaformation nach Ballonangioplastie. Obwohl LXRs als wichtige Regulatoren inflammatorischer Genexpression in Makrophagen identifiziert wurden, ist der zugrundeliegende Mechanismus weitgehend unbekannt. In der Originalarbeit 5 wurde der Effekt von LXR Liganden auf die Zytokin induzierte Expression von CRP in humanen Hepatozyten untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass LXR Liganden die CRP Genexpression konzentrationsabhängig inhibieren. Als zugrundeliegender Mechanismus wurde die Inhibierung der Zytokin induzierten Dissoziation des nukleären Korepressors NCoR vom CRP Promoter identifiziert. Diese Daten zeigen eine neuen Mechanismus inflammatorischer Genregulation durch LXRs. Dieser Mechanismus ist möglicherweise auch für andere Gene und andere nukleäre Rezeptoren von Bedeutung.

Coronary artery disease is the leading cause of mortality and morbidity in industrialized countries. Previous studies have shown that activation and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) play a decisive role in vascular proliferative diseases such as atherosclerosis and restenosis. A better understanding of the molecular mechanisms involved in VSMC activation and cell cycle regulation are necessary to develop novel therapeutic strategies for the prevention and treatment of the aforementioned diseases. Activation of the local and systemic renin-angiotensin system is directly and indirectly involved in mechanisms of vascular remodeling during chronic hypertension. Our data demonstrate that long term pretreatment with angiotensin II (Ang II) induced a significant increase in PDGF-BB-directed migration of VSMCs. Expression of integrins, which play an important role in cell migration, was not altered. However, long term stimulation with Ang II increased both expression of the proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) and focal adhesion kinase (FAK), which both participate in integrin-dependent signaling, and enhance phosphorylation of Pyk2 and ERK 1/2. Furthermore, immunofluorescence and Western blot analysis demonstrated translocation of Pyk2 from the plasma membrane to the cytosol, as well as perinuclear enrichment of ERK 1/2 protein after Ang II treatment. Thus, our data suggest that changes in the levels of Pyk2 and ERK 1/2 phosphorylation as well as their subcellular translocation are important for the enhanced chemotactic response of VSMCs after Ang II pretreatment. Hypoxia plays an important role in vascular remodeling and directly affects VSMC functions. Thus, we investigated the effects of hypoxia on adhesion mechanisms in human VSMCs. Our data indicate that hypoxia significantly increases cell adhesion to extracellular matrix proteins. In addition, hypoxia induced a time-dependent activation of ERK 1/2 and p38 MAPK in human VSMCs. Previous studies have shown that beta1-integrins mediate adhesion of VSMCs to extracellular matrix proteins. As evidenced by flow cytometry, we found that hypoxia induced activation of beta1-integrins by exposing a conformationally sensitive epitope on the beta1-subunit. These results demonstrate that hypoxia enhances adhesion of VSMCs on extracellular matrix proteins by activating beta1-integrins. Accumulating evidence suggests that C-reactive protein (CRP), in addition to being a predictor of coronary events, may have direct actions on the vessel wall in the evolution of atherosclerosis. Our data demonstrate that CRP induces caspase-mediated apoptosis of human VSMCs. Using DNA microarray analysis we identified the growth arrest- and DNA damage–inducible gene 153 (GADD153) as CRP-regulated gene. Small interfering RNA (siRNA) specifically targeted to GADD153 reduced CRP-induced apoptosis. GADD153 staining also specifically colocalized to apoptotic VSMCs in human coronary lesions, further supporting a functional role for GADD153 in CRP-induced cell death. These results demonstrate that GADD153 is a CRP-regulated gene in human VSMCs and plays a causal role in CRP-induced apoptosis. The liver X receptors (LXRs) are important regulators of cholesterol homeostasis and inflammatory gene expression in macrophages. We demonstrated that LXRs are expressed and functional in human VSMCs. LXR ligands inhibited mitogen-induced VSMC proliferation and cell cycle progression. Furthermore, LXR agonists suppressed mitogen-induced degradation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1, attenuated cyclin D1 and cyclin A expression, and inhibited the expression of S phase-regulatory minichromosome maintenance protein 6. Stabilization of p27kip1 by LXR ligands was mediated by suppressing the transcriptional activation of the S phase kinase-associated protein 2 (Skp2), an F-box protein that targets p27Kip1 for degradation. Finally, neointima formation in a model of rat carotid artery balloon injury was significantly attenuated after treatment with a LXR ligand compared with vehicle-treated animals. These data demonstrate that LXR ligands inhibit VSMC proliferation and neointima formation after balloon injury and suggest that LXR ligands may constitute a novel therapy for proliferative vascular diseases. Previous studies identified LXRs as important regulator of inflammatory gene expression in macrophages. However, the mechanism underlying the repression of inflammatory genes by LXRs is poorly understood. We showed that synthetic LXR ligands inhibit cytokine- induced CRP expression in human hepatocytes in a receptor-dependent manner. Chromatin immunoprecipitation assays indicated that the nuclear receptor corepressor (NCoR) is present on the endogenous CRP promoter under basal conditions. Cytokine-induced clearance of nuclear receptor corepressor complexes was inhibited by LXR ligand treatment, maintaining the CRP gene in a repressed state. Our observations identified a novel mechanism of inflammatory gene regulation by LXR ligands. Thus, inhibition of CRP expression by LXR agonists may provide a promising approach to impact initiation and progression of atherosclerosis.