APIT - das zytolytische Toxin der Aplysia punctata-Tinte:: Eine biochemisch-molecularbiologische Charakterisierung und Aufklärung des toxischen Prinzips

Abstract

"Seehasen" sind marine Gastropoden, die den Schutz einer harten äußeren Schale zugunsten einer Reihe von chemischen Abwehrstrategien und defensiven Verhaltensweisen aufgegeben haben. Ihre wohl dramatischste - und sehr erfolgreiche - Waffe ist die gerichtete Abgabe einer purpurfarbenen Tinte bei Kontakt mit einem Prädator. In den späten 80iger Jahren des letzten Jahrhunderts wurde aus der Tinte der indopazifischen Art Aplysia kurodai ein hochmolekulares Glykoprotein aufgereinigt, das sich durch antibakterielle und spezifische zytolytische Eigenschaften auszeichnete - Aplysianin P tötete selektiv Tumorzellen. Der Mechanismus dieses Effekts blieb ungeklärt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein zytolytisches Glykoprotein aus Tinte der europäischen Art Aplysia punctata isoliert. APIT (A. punctata ink toxin) ist ein 60 kD-Protein mit spärlicher O-Glykosilierung. Absorptionspeaks bei 390/470 nm enthüllten den Kofaktor Flavin, der sich in anschließenden Experimenten als FAD weiter spezifizieren ließ. Die in eine Aminosäurenfolge übersetzte cDNA von APIT enthält das klassische dinukleotid-bindende Motiv FAD-abhängiger Oxidoreduktasen und ein GG-Motiv, das typisch für L-Aminosäure Oxidasen ist. APIT, wie auch Aplysianin P, löst unter in vitro-Bedingungen den Tod von Tumorzellen aus. Dieser ist durch einen schnellen Verlust von Stoffwechselaktivität und die Permeabilisierung der Zellmembran gekennzeichnet. Es ließen sich keinerlei Hinweise auf apoptotische Prozesse sammeln. Eine Analyse des Proteoms der behandelten Zellen ergab Hinweise auf eine Beteiligung von reaktiven Oxygenspezien am zytolytischen Geschehen. Demgemäß ließ sich zeigen, dass es sich bei APIT um eine L-Aminosäuren Oxidase handelt, die H2O2 über die oxidative Desaminierung von L-Lysin und L-Arginin aus dem Zellkulturmedium generiert. Das produzierte H2O2 ist alleiniger Auslöser der schnellen Zytolyse; diese lässt sich durch Zugabe von Catalase vollständig unterdrücken. Die Sekretion von Oxidasen ist ein bei Tieren nicht unübliches Mittel zur Verteidigung und auch Seehasen scheinen solch eine Strategie der ROS-Generierung zur Abwehr von Feinden einzusetzen.

"Sea hares" are marine gastropods which have replaced the physical protection of the hard outer shell with an elaborate set of chemical and behavioral defense techniques. The most dramatic - and very successful - one is the dicharge of a purple ink upon predation. In the late 1980's a high-molecular glycoprotein with antibacterial and specific cytolytic properties was purified from ink of the indopacific sea hare Aplysia kurodai - Aplysianin P selectively killed tumor cells. The mechanism of its effect so far has not been elucidated. In the present thesis a cytolytic glycoprotein from ink of the European species Aplysia punctata was isolated. APIT (A. punctata ink toxin) is a 60 kD-protein with sparse O-glycosilation. Absorption peaks at 390/470 nm revealed a flavin cofactor which subsequently turned out to be FAD. The translated sequence of the cloned cDNA contains a classical dinucleotide binding motive of FAD-dependent oxidoreductases and a GG-motive of L-amino acid oxidases. APIT, like Aplysianin P, in vitro triggers tumor cell death which is characterized by a rapid loss of metabolic activity and membrane integrity. No hints on apoptotic events are detected. Proteome analysis of treated cells revealed the involvement of reactive oxygen species (ROS) in the cytolytic process. Accordingly it is demonstrated that APIT functions as L-amino acid oxidase producing H2O2 via oxidative deamination of L-lysine and L-arginine from culture medium. The generated H2O2 is solely responsible for the fast cytolytic response, because the latter is abolished by addition of catalase. Secreted oxidases are a popular means of defence in animals and sea hares seem to share this strategy of self-defence via generation of ROS from a yet not verified natural substrat.