dc.contributor.author
Gallego Llerena, Julian
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:54:21Z
dc.date.available
2011-01-06T12:56:00.476Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8591
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12790
dc.description
1\. Motivation und Zielstellung 1 2\. Einleitung 3 2.1 Aufbau und Funktion von
Humanhaut 3 2.2 Auswirkungen der UV-Strahlung auf die biologischen Systeme der
Haut 6 2.3 Bildung von Reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Humanhaut durch
energiereiche Strahlung 8 2.3 Schutzmechanismen der Haut vor UV-Strahlung und
ROS 9 2.4 Nitroxyl-Radikale 11 3\. Material und Methoden 14 3.1 Materialien 14
3.1.1 Nitroxyl-Radikale 14 3.1.2 Mikroemulsion 16 3.1.3 Stabile Radikale 17
3.1.4 Weitere Chemikalien und Materialien 18 3.1.5 Verwendete Geräte 20 3.2
Analytische und präparative Methoden 21 3.2.1 UV/VIS-Spektroskopie 21 3.2.2
Bestrahlungsquellen 21 3.2.3 ESR-Spektroskopie/Tomografie 23 3.2.4
Quantifizierung des DPPH Standards mit der ESR 29 3.2.5 Humanhaut 31 3.2.5.1
Exzidierte Humanhaut 31 3.2.5.2 Hauthomogenate 33 3.2.6 Sonnenbrandzellen 33
3.2.7 Bestimmung der Dicke der Epidermis 35 3.3 Synthese und Charakterisierung
des neuen Nitroxyl-Radikals 5-Doxylhexansäuremethylester (DHME) 36 3.4
Statistik und Auswertung 39 4\. Entwicklung eines Verfahrens zur Bestimmung
der antioxidativen Kapazität von exzidierter Humanhaut und Überprüfung des
reduktiven Potentials ausgewählter Antioxidantien mit diesem Verfahren 40 4.1
Notwendigkeit eines neuen Verfahrens 43 4.2 Versuchsprinzip 43 4.2.1
Versuchsaufbau 46 4.3 Darstellung der Problematik vom Modellradikal DPPH in
diesem Verfahren 47 4.3.1 DPPH in wässrigen Lösungen 47 4.3.2 Stabilität der
verwendeten DPPH-Lösung 48 4.4 Ergebnisse der Verfahrensentwicklung 49 4.4.1
Stabilität der DPPH-Stammlösung 49 4.4.2 Quantifizierung der DPPH-
Konzentration 51 4.4.3 Reaktion der DPPH-Lösung in der Diffusionszelle 54
4.4.4 Eindringtiefenbestimmung von DPPH mit ESI-TOF-MS und Dickenbestimmung 58
4.4.4.1 Mikroskopische Dickenbestimmung 58 4.4.4.2 Bestimmung der
Eindringtiefe von DPPH mit ESI-TOF-MS 59 4.4.5 Temperaturabhängige Reduktion
von DPPH 61 4.4.6 Ermittlung der optimalen Reaktionszeit 62 4.5 Beschreibung
der Vorgänge bei der Reaktion der Haut und dem DPPH während eines Experiments
64 4.5.1 Hypothese zur sinkenden DPPH-Konzentration in der Donor-Zelle 64 4.6
Ergebnisse zur antioxidativen Kapazität von exzidierter Humanhaut an dem neu
etablierten Verfahren 67 4.6.1 Intraindividuelle Schwankungen einer
Spenderhaut 67 4.6.2 Interindividuelle Schwankungen der Spenderhaut 69 4.6.3
Hemmung reduzierender Enzyme durch SH-Reagenzien 71 4.6.4 Einfluss der
Mikroemulsion auf das Verfahren 75 4.6.5 Quantifizierung des
Reduktionsvermögens 76 4.7 Bewertung von Spinsonden als Radikalfänger 78 4.7.1
Der Standard Ascorbinsäurepalmitat 78 4.7.2 Überprüfung der Spinsonden TEMPOL,
DHME, DPS und CAT-1 auf ihr reduktives Potential nach Applikation auf
exzidierter Humanhaut 80 4.8 Zusammenfassung und Diskussion 86 5\. Weitere
Verfahren zur Erfassung von UV-induzierten Schäden in exzidierter Humanhaut
und deren Vermeidung durch Protektiva 89 5.1 Sonnenbrandzellen-Methode 89
5.1.1 Untersuchungen von Sonnenbrandzellen an exzidierter Humanhaut 91 5.1.2
Parameterentwicklung 92 5.1.3 Ergebnisse 94 5.2 Untersuchungen an
Hauthomogenaten unter Verwendung der ESR-Spektroskopie 98 5.2.1
Versuchsprinzip 99 5.2.2 Ergebnisse 99 5.3 Nachweis von
Lipidperoxidationsprodukten in Hauthomogenaten 101 5.3.1 Versuchsaufbau 102
5.3.2 Ergebnisse 103 5.4 Zusammenfassung 104 6\. ESR-Tomografie mit
exzidierter Humanhaut 106 6.1 Auswahl eines geeigneten Applikationsweges und
der -form 108 6.2 Nitroxyl-Radikale in exzidierter Humanhaut nach epikutaner
Applikation 110 6.2.1 Entwicklung der Parameter für die Applikation der
Nitroxide auf der Haut 110 6.3 Eingesetzte Nitroxide 112 6.4 Auswahl der
Nitroxide 113 6.5 Ergebnisse der ESR-Untersuchungen an Nitroxid-beladenen
Hautproben 115 6.5.1 Einfluss der Spenderhaut auf die Verteilung und das
Ausmaß der Bioreduktion der Nitroxide durch hauteigene Mechanismen 115 6.5.2
Verteilung der Nitroxide DHME und TEMPOL in Humanhaut 118 6.5.3
Quantifizierung der Nitroxyl-Radikale in der Haut 121 6.5.4 Einfluss des DPPH
Standards auf die Auswertung der ESR-Tomogramme 121 6.6 Zusammenfassung 123
7\. Bestrahlungsexperimente 125 7.1 Exzidierte Humanhaut als Modellsystem für
Bestrahlungs-versuche 126 7.2 Die Nitroxide TEMPOL und DHME 126 7.3 Ergebnisse
der Bestrahlungsexperimente von Nitroxid-beladener Haut mit unterschiedlichen
Strahlungsquellen 127 7.3.1 Bestrahlungen mit einem Sonnensimulator 127 7.3.2
Bestrahlung mit einem UVC-Strahler 133 7.3.3 Wirkung von UV-Strahlung auf, mit
Iodacetamid-gehemmter, Humanhaut 137 7.4 Zusammenfassung 139 8\.
Zusammenfassung, Fazit und Ausblick 142 9\. Präsentationen 148
Literaturverzeichnis 149
dc.description.abstract
Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Entwicklung eines
Verfahrens zur Quantifizierung der antioxidativen Kapazität von exzidierter
Humanhaut, sowie deren Erhöhung durch neuartige Radikalfänger (Nitroxyl-
Radikale). Ein weiteres Anliegen dieser Arbeit bestand in der Untersuchung der
Penetrationseigenschaften ausgewählter Nitroxyl-Radikale mit Hilfe der ESR-
Spektroskopie und Tomografie. Außerdem sollte das Verhalten der Nitroxide
Humanhaut nach UV-Bestrahlung untersucht werden. Als wichtigste Ergebnisse der
Arbeit sind folgende Punkte zu nennen: • Die antioxidative Kapazität der
Epidermis von exzidierter Humanhaut konnte bestimmt und mit dem stabilen
Modell-Radikals Diphenylpicrylhydrazyl, mittels der UV/VIS-Spektroskopie,
quantifiziert werden. • Topisch applizierte Antioxidantien konnten mit diesem
Verfahren in situ auf ihr reduktives Potential hin getestet werden. • Die, in
dieser Arbeit, topisch applizierten Spinsonden zeigten ein erhöhtes
Reduktionsvermögen gegenüber DPPH. Die Nitroxide TEMPOL
(4-Hydroxy-2,2,6,6-tertramethylpiperidin-1-oxyl) und DHME
(5-Doxylhexansäuremethylester) reduzierten das Modell-Radikal DPPH effektiver
als das Standardantioxidans Ascorbinsäurepalmitat. • Die antioxidative
Kapazität von Humanhaut ließ sich mit Thiolgruppen-Hemmstoffen auf ein Minimum
reduzieren • Es konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an UV-induzierten
Sonnenbrandzellen in exzidierter Humanhaut durch die Substanzen wie
Ascorbinsäurepalmitat, TEMPOL und DHME verringert werden konnte • Es konnte
mit Hilfe der ESR-Tomografie die Penetration der Nitroxyl-Radikale TEMPOL und
DHME verfolgt werden. Außerdem konnten unterschiedliche Verteilungsprofile der
beiden Spinsonden erstellt werden. Dabei war zu beobachten, dass sich TEMPOL
vermehrt im mittleren und unteren Bereich der Epidermis und DHME im oberen
Bereich der Dermis aufhielt. • Mit Hilfe der Hyperfeinaufspaltung der ESR-
Spektren von TEMPOL und DHME konnte ein Polaritätsprofil der unmittelbaren
Umgebung der Spinsonden festgestellt werden. Dabei hielt sich das hydrophilere
TEMPOL in einer polareren Umgebung auf als das lipophilere Nitroxid
5-Doxylhensäuremethylester. • Mit der Reaktion der Spinsonden, nach
Bestrahlung von exzidierter Haut mit UV-Strahlung (UV A/B und C), zu ESR-
stummen Verbindung über die gesamte vermessen Hauttiefe konnte gezeigt werden,
dass der Wirkungsbereich von UV-Strahlung über die Eindringtiefe hinausgeht. •
Es konnte eine verstärkte Reduktion der Spinsonden DHME und TEMPOL, in der
Haut, nach UV-Bestrahlung und nach Hemmung des antioxidative Systems durch SH-
Reagenzien festgestellt werden. UV-induzierte Folgeprodukte, wie reaktive
Sauerstoffspezies, wurden vermehrt durch, in der Haut verteilte, Nitroxide
abgefangen.
de
dc.description.abstract
The present thesis was focused on the development of a method to quantify the
antioxidant capacity of excised human skin, and increase by novel radical
scavengers (nitroxyl radicals).A second aim of this work was to study the
penetration properties of selected nitroxyl radicals using EPR spectroscopy
and tomography. Finally, the behavior of the nitroxides in human skin after UV
irradiation is investigated. The main results of the investigations are: • The
antioxidant capacity of the epidermis of excised human skin was determined and
quantified as equivalent of the stable radical Diphenylpicrylhydrazyl, by
means of UV/VIS spectroscopy. • It was possible to estimate, in situ, the
reductive potential of topically applied antioxidants. • The topically applied
spin probes showed an increased reducing activity compared to untreated skin.
The nitroxides DHME (5-doxyl-hexanoic acid methylester) and TEMPOL
(4-hydroxy-2,2,6,6-tertramethylpiperidine-1-oxyl) reduced the model radical
DPPH more effective than the antioxidans ascorbic acid palmitate (used as
standard). • The antioxidant capacity of human skin could be reduced to a
minimum with inhibitors of sulfhydril-groups • It was shown that the number of
UV-induced sunburn cells in excised human skin could be reduced by substances
such as ascorbic acid palmitate, TEMPOL and DHME • The penetration of the
nitroxyl-radicals TEMPOL and DHME could be pursued by means of EPR tomography.
Also there could be seen different distribution profiles of the two spin
label. It was an increase amount of TEMPOL in the middle and bottom of the
epidermis whereas DHME was staying in the top of the dermis. • Also there
could be detected a polarity profile of the immediate environment of the spin
probes by means of hyperfine splitting of ESR spectra of TEMPOL and DHME. As a
hydrophilic spin label TEMPOL remains in polar environment compared to the
lipophilic nitroxide 5-doxyl hexanoic acid methylester. • After UV-irradiation
(UV A /B and C) of excised skin, the reaction lead to ESR-silent spin probes
over the entire measured skin depth. It could be shown that the area of
influence of UV radiation goes beyond the penetration depth. • There was a
greater reduction of the spin probes TEMPOL and DHME, in the skin, after UV-
irradiation and inhibition of the antioxidant system by SH-reagents. UV-
induced secondary products, like reactive oxygen species, could be scavenged
by nitroxides.
en
dc.format.extent
II, X, 158 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
antioxidant capacity
dc.subject
radical scavenger
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften
dc.title
Bestimmung der antioxidativen Kapazität von exzidierter Humanhaut und
Untersuchungen der protektiven Eigenschaften von Nitroxyl-Radikalen
dc.contributor.contact
juliangallego@web.de
dc.contributor.inspector
Univ. Prof. Dr. R. Müller / Univ. Prof. Dr. H.H. Pertz
dc.contributor.firstReferee
Univ. Prof. Dr. H.H. Borchert
dc.contributor.furtherReferee
Univ. Prof. Dr. Melzig
dc.date.accepted
2010-11-12
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000020133-8
dc.title.translated
Determination of antioxidant capacity of excised human skin and analysis of
protective properties of nitroxyl radicals
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000020133
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000008834
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access