Molecular mechanisms of mechanotransduction: functional analysis of the role of STOML3

Abstract

The ability of complex vertebrate organisms to perceive various mechanical stimuli through sensory neurons innervating skin is crucial for interaction with the physical world. Mechanotransduction is the conversion of a mechanical stimulus into a biological response. The molecular basis of the mechanical transduction machinery is formed by specialized ion channels, which can form large multiprotein complexes together with different accessory proteins (Delmas et al, 2011; Ernstrom & Chalfie, 2002; Gillespie & Walker, 2001) This work is focused on characterisation of STOML-3 protein, which is a member of the large protein family characterised by the presence of a stomatin domain. Functionally, STOML-3 was first described by us in connection with loss of mechanosensitivity in stoml-3 null mice (Wetzel et al, 2007). A pronounced effect on mechanosensation in this mouse and the homology of STOML-3 with the MEC-2 protein, one of the main components of mechanotransducing machinery in C.elegans, allows us to hypothesise that STOML-3 is an essential component of mammalian mechanotransducing complex. Thus, I take an advantage of cell biology techniques in combination with gene engineering methods in order to verify this hypothesis, to elucidate possible molecular mechanisms by which STOML-3 functions and to identify STOML-3 interacting proteins as putative components of mammalian mechanotransducing machinery. In the first part of my dissertation I present data regarding STOML-3 cell biology and dynamics, in vitro molecular interactions and a novel approach for purification of endogenous protein complexes from animal tissues. I also describe a novel STOML-3 positive vesicular pool, which we term the transducosome, and believe it is important for STOML3-mediated processes. The second part of this work is focused on characterisation of STOML-3 expression pattern in the mouse, using two transgenic mouse lines that were created in the course of this project and which are also described here. I describe STOML-3 expression pattern within previously reported tissues, as well as report about additional tissues and cellular types in which STOML-3 was detected using these transgenic mice. In conclusion, I discuss potential mechanisms of STOML-3 function, based on our recent results and results presented in this work. The apparent role of STOML-3 in mechanotransduction in mammals makes this protein an important object of further studies and a potential pharmacological target. I demonstrate that STOML-3 is located in a dynamic vesicular pool and possibly can change characteristics of the plasma membrane upon incorporation. Additionally, I show that STOML-3 expression is not restricted to neuronal tissues, but also present in cells from additional tissues that are reported to be able to detect and react on mechanical stimulation (e.g. olfactory epithelium and bone tissues). Thereby, the role of STOML3 in mechanosensation may be more general in character, than previously thought.

Die Fähigkeit von Vertebraten verschiedene mechanische Reize durch in der Haut eingebettete sensorische Neurone wahrzunehmen, ist essentiell für die Interaktion mit der Umwelt. Mechanotransduktion ist die Umwandlung eines mechanischen Reizes in eine zelluläre Antwort. Spezialisierte Ionenkanäle, die große Multiproteinkomplexe mit verschiedenen akzessorischen Proteinen formen können, bilden die molekulare Grundlage der Wahrnehmung mechanischer Kräfte (Delmas et al., 2011; Ernstrom & Chalfie, 2002; Gillespie & Walker, 2011). Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Charakterisierung von STOML-3, einem Mitglied der großen, durch die Anwesenheit einer Stomatin-Domäne charakterisierten Proteinfamilie. STOML-3 wurde in unserem Labor erstmals funktionell in Verbindung mit einem Teilverlust der Mechanosensitivität in stoml3-defizienten Mäusen beschrieben (Wetzel et al., 2007). Aufgrund des Effekt von STOML-3 auf die Mechanosensitivität der Maus und der Homologie von STOML-3 und MEC-2, einer der Hauptkomponenten der Mechanotransduktionsmaschinerie in C. elegans, ist anzunehmen, dass STOML-3 ein essentieller Bestandteil des mammalischen Mechanotransduktionskomplexes ist. Mittels zellbiologischer und gentechnischer Methoden wird versucht diese Hypothese zu verifizieren sowie mögliche der Funktion von STOML-3 zugrunde liegende molekulare Mechanismen aufzuklären. Darüber hinaus werden Interaktionspartner von STOML-3 als putative Komponenten der mammalischen Mechanotransduktionsmaschinerie identifiziert. Der erste Teil der Dissertation thematisiert die zellbiologische Charakterisierung und die Dynamik von STOML-3. Außerdem werden in vitro molekulare Interaktionen von STOML-3 studiert und neue Ansätze zur Aufreinigung endogener Proteinkomplexe der Mausa ufgezeigt. Darüber hinaus beschreibe ich einen STOML-3 positiven Vesikelpool, Transducosome getauft, der als für STOML-3 vermittelte Prozesse notwendig erachtet wird. Der zweite Teil der Arbeit ist auf die Charakterisierung der Expression von STOML-3 in zwei transgenen Mauslinien, die im Rahmen des Projekts generiert wurden, fokussiert. Die Expressionmuster von STOML3 werden in bereits dokumentierten Geweben analysiert. Zusätzlich detektiere ich STOML-3 in bisher nicht dokumentierten Geweben und Zelltypen. Schließlich diskutiere ich unter Berücksichtigung jüngster Ergebnisse unseres Labors und der in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Ergebnisse einen potentiellen, der Funktion von STOML-3 zugrunde liegenden Mechanismus. Die beschriebene Rolle von STOML-3 in der Mechanotransduktion der Säugetiere macht dieses Protein zu einem wichtigen Objekt weiterführender Studien und zeichnet es als potentielles pharmakologisches Ziel aus. STOML-3 ist in einem dynamischen Vesikelpool lokalisiert und übt nach Inkorporation in die Plasmamembran charakteristische Effekte auf diese aus. Darüber hinaus lokalisiere ich STOML-3 nicht nur in neuronalem Gewebe, sondern auch in Zellen nicht- neuronalen Gewebes (z.B. olfaktorisches Gewebe, Knochengewebe), die ebenfalls mechanische Reize detektieren und auf diese reagieren können. Unter Berücksichtigung der beschriebenen Erkenntnisse ist anzunehmen, dass die Funktion von STOML-3 in der Mechanosensation weitreichender als bisher angenommen ist.