The blood-brain barrier is the interface between the blood and the central nervous system; one of its key elements is the brain capillary endothelium. The paracellular cleft between the brain capillary endothelial cells is sealed by the tight junctions (TJ), protein complexes that restrict the free diffusion of water and water soluble molecules across that space. The intracellular zonula occludens protein 1 (ZO-1) and the transmembranal and TJ- specific protein occludin were the first TJ molecules identified. The structure and physiology of both proteins is not well understood; ZO-1 is considered the scaffolding protein of the TJ, and occludin has been assumed to play a regulatory role on the TJ behavior. Based on in-vitro studies using recombinant fragments of occludin, a redox sensitive function of occludin was hypothesized. Here, it is shown that occludin dimerizes in a redox sensitive manner by forming an intracellular disulfide bridge involving the cysteine 409 (in the C-terminal domain of human occludin). The dimerization is found to be needed for the recruitment of ZO-1 to the plasma membrane. When expressed in a TJ-free cell system, occludin reached the cell membrane and interacted in trans with itself. When coexpressed with ZO-1, occludin formed membranal strands and helped ZO-1 to reach the plasma membrane. Under hypoxia or TNF-α induced redox stress, occludin did not dimerize, lost its ability to interact in trans, dissociated from ZO-1, and both proteins were delocalized from the plasma membrane. The substitution of the cysteine 409 for alanine (C409A) prevented the dimerization of occludin and the recruitment of ZO-1 to the cell membrane. Although the occludin C409A mutant reached the cell membrane, it did not recruit ZO-1 or formed strands. Based on the experimental data a structural model for the redox-sensitive dimerization of occludin and the interaction of occludin and ZO-1 was proposed. This work demonstrates how the cellular expression and interplay of occludin and ZO-1 are redox sensitive. After the onset of hypoxia, changes in the intracellular redox potential hinder the interaction of occludin with ZO-1, a novel mechanism that contributes to the regulation of TJ. Thus, this work contributes to a better understanding of the function and regulation of TJ in the brain capillaries of patients undergoing hypoxic and/or inflammatory conditions.
Die Blut-Hirn-Schranke ist die Schnittstelle zwischen dem Blut und dem Zentralnervensystem. Die Funktion baut hierbei auf kapilläre Endothelzellen im Gehirn auf. Der parazelluläre Spalt zwischen den Endothelzellen im Gehirn ist durch Tight Junctions (TJ) verschlossen, einen Membranproteinkomplex, der die freie Diffusion von Wasser- oder wasserlöslichen Molekülen verhindert. Das intrazelluläre Zonula occludens Protein 1 (ZO-1) und das transmembrane, TJ- spezifische Protein Occludin waren die ersten identifizierten TJ-Moleküle. Die Struktur und die Physiologie dieser beiden Moleküle sind bisher nicht eindeutig geklärt. Es wird angenommen, dass ZO-1 das Protein für den Gerüstbau der TJ ist und Occludin das Regulationsverhalten der TJ bestimmt. Ausgehend von einer Studie in-vitro mit rekombinierten Occludinfragmenten wird eine redox-empfindliche Funktion von Occludin vermutet. Hier wird zum ersten Mal demonstriert, dass eine Dimerisierung von Occludin auf eine redox-sensibel Weise durch das Ausbilden einer intrazellulären Disulfidbrücke mit Cysteine 409 (am C-terminalen Ende von humanem Occludin) stattfindet. Dieses Dimer wird für die Anlagerung von ZO-1 an die Plasmamembran benötigt. Wenn Occludin in einem TJ-freien Zellsystem synthetisiert wird, erreicht es die Zellmembran wo es in trans, mit sich selbst interagiert. Falls in diesem System aber ebenfalls ZO-1 synthetisiert wird, formt es mit Occludin membranartige Stränge. Occludin, als dimer, erleichtert ZO-1 die Plasmamembran zu erreichen. Durch Sauerstoffmangel oder auch oxidativen Stress, der durch TNF- α hervorgerufen wurde, kann Occludin das Dimer nicht ausbilden und kann dadurch nicht mehr mit sich selbst-interagieren, trennt sich von ZO-1, sodass beide Proteine von der Plasmamembran delokalisiert werden. Wird Cystine 409 durch Alanine (C409A) ersetzt, wird sowohl die Dimerisierung von Occludin als auch die Anlagerung von ZO-1 an die Zellmembran verhindert. Obwohl die Occludin C409A Mutante die Zellmembran erreicht, regiert es nicht mit ZO-1 oder bildet Stränge aus. Basierend auf diesen Experimentdaten ist ein strukturelles Modell des redox-sensitiven Dimers von Occludin und der Interaktion von Occludin und ZO-1 geplant. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die zelluläre Expression und das Zusammenspiel von Occludin und ZO-1 redox-sensibel sind. Bei beginnender Hypoxie (Sauerstoffmangel) verändert sich das interzelluläre Redoxpotenzial, welches das Zusammenspiel von Occludin und ZO-1 verhindern; diesen neuartigen Mechanismus, der zur Regulation der TJ beiträgt. Dadurch trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der Funktion und Regulation der TJ in den Gehirn- Kapillaren von Patienten bei, die unter Sauerstoffmangel oder/und Entzündung leiden.
