Untersuchung des konsomen Rattenstammes MWF-8SHR zur Analyse eines Albuminurie-QTL bei der MWF-Ratte

Abstract

Eine erhöhte Albuminausscheidung über den Urin (UAlb) stellt einen unabhängigen Risikofaktor für die Entwicklung von chronischen Nieren- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen dar. Es handelt sich hierbei um eine komplexe, polygenetisch und multifaktoriell beeinflusste Erkrankung, deren pathogenetische Ursachen bislang weitgehend unbekannt sind. Ein frühzeitiger Indikator für die spätere Entwicklung von arterieller Hypertonie, glomerulärer Hyperfiltration und nachfolgenden Nierenerkrankungen ist eine angeborene verminderte Nephronenanzahl. Die Munich Wistar Frömter-Ratte (MWF) stellt ein ingezüchtetes Tiermodell dar, welches eine reduzierte Nephronenanzahl sowie eine spontane Hypertonie und frühzeitig einsetzende Albuminurie (UAlb) als ein erblich bedingtes Merkmal aufweist. In einer in der Arbeitsgruppe durchgeführten Kosegregations- und Kopplungsanalyse zwischen der MWF- und der Spontan Hypertensiven-Ratte (SHR) konnte ein signifikanter Quantitative Trait Lokus (QTL) mit Kopplung zur Albuminurie auf Rattenchromosom (RNO) 8 nachgewiesen werden. Um den Einfluss dieses QTL auf Albuminurie, Nierenstruktur und Nephronenanzahl zu testen wurde der konsome Stamm MWF-8SHR etabliert. Hierfür wurde ausgehend von den Parentaltierstämmen MWF und SHR das SHR RNO8 in den isogenetischen MWF Hintergrund übertragen. Männliche MWF-Tiere weisen bereits in der 8. Woche eine gegenüber SHR-Männchen 55fach erhöhte UAlb auf. Im Gegensatz hierzu ergab die phänotypische Untersuchung des konsomen Stammes MWF-8SHR eine fast vollständige Eliminierung der frühzeitigen UAlb. Im weiteren Verlauf bis zur 32. Woche zeigte sich ein ähnlicher Befund. MWF- Männchen entwickeln in diesem Zeitraum eine steigende UAlb bis in den für Ratten nephrotischen Bereich (> 150 mg/24h). Die UAlb der konsomen Männchen war dagegen verglichen mit MWF-Männchen zu jedem Zeitpunkt signifikant supprimiert. Die Untersuchung der Gesamt-Nephronenanzahl in der 4. Woche ergab beim konsomen Stamm eine gleichwertig verminderte Nephronenanzahl wie beim MWF-Stamm. Gegenüber SHR-Tieren war die Nephronenanzahl der konsomen Tiere um 36% reduziert (p<0,0001). Die zur Einschätzung der strukturellen Nierenveränderungen betrachteten Parameter Glomerulosklerose, tubulointerstitielle Schädigungen, renale interstitielle Fibrose sowie renale Kollagen III mRNA Expression waren in der 24. Woche sowohl bei MWF- wie auch bei konsomen MWF-8SHR-Tieren signifikant höher als bei SHR-Tieren. Bei Blutdruckmessungen in der 14. und 24. Woche lag der Blutdruck der konsomen Tiere intermediär zwischen den Werten der Parentaltiere. Um zu prüfen ob der Einfluss des QTL auf die UAlb geschlechtsabhängig ist, wurden konsome MWF- 8SHR-Weibchen untersucht. Im Vergleich zu MWF-Weibchen wurden bei diesen zu allen untersuchten Zeitpunkten hochsignifikant geringere UAlb-Werte nachgewiesen. Die Betrachtung von hetorozygoten konsomen F1-Tieren erlaubt Rückschlüsse auf einen Gen-Dosis Effekt des MWF RNO8. Es zeigte sich ein nicht vollständig rezessiver Einfluss auf die Albuminurie. Um eine effektive Suche nach Albuminurie-Genen auf RNO8 durch Verkleinerung des QTL zu gewährleisten, wurde in der Arbeitsgruppe die Zucht kongener Linien aus den Parentaltierstämmen eingeleitet. Bei der Untersuchung vier bereits etablierter kongener Linien zeigte sich ein sprunghafter Anstieg um 11,5 mg/24h von niedrigen zu hohen UAlb-Werten zwischen den beiden Stämmen MWF.SHR(D8Rat71-D8Rat35) und MWF.SHR(D8Rat71-D8Rat19). Aufgrund dieser Ergebnisse lässt sich die Zielregion, die ursprünglich 30 cM umfasste, auf einen 18,6 cM großen Bereich zwischen den Markern D8Rat35 und D8Rat19 eingrenzen. Die Ergebnisse dieser Arbeit machen deutlich, dass auf RNO8 mindestens ein Gen liegen muss, welches die frühzeitige Manifestation und Progression der UAlb bei MWF entscheidend beeinflusst. Anders als bei bisher untersuchten QTL konnte hier nachgewiesen werden, dass der Einfluss den das QTL auf RNO 8 auf die UAlb hat, völlig unabhängig vom Nephronen-Defizit ist. Weiterhin wurde gezeigt, dass kein kausaler Zusammenhang von strukturelle Nierenveränderungen oder Bluthochdruck mit der UAlb besteht. Trotz eines sexuellen Dimorphismus bei MWF-Ratten, konnte die hohe Relevanz des QTL auf RNO 8 für die UAlb für beide Geschlechter belegt werden. Die vorliegenden Untersuchungen des konsomen Rattenstammes MWF-8SHR sowie kongener Linien ermöglichen die weitere Identifizierung genetischer Faktoren und molekularer Mechanismen die in der Pathogenese chronischer Nierenerkrankungen von entscheidender Bedeutung sind.

An elevated urinary albumin excretion (UAE) is an independent risk factor for the development of chronic nephropathy and cardiovascular diseases. Albuminuria is a complex phenotype that is influenced by environmental and genetic factors that are hardly identified yet. A reduced nephron number at birth is an important predictor for the development of arterial hypertension, glomerular hyperfiltration and renal disease with age. In the hypertensive Munich Wistar Frömter (MWF) rat model a reduced nephron number and increased albuminuria are inherited traits. In our cross-breeding and linkage studies including the MWF and the spontaneously hypertensive (SHR) rat we demonstrated a major quantitative trait locus (QTL) on rat chromosome (RNO) 8 linked to albuminuria after the age of 14 weeks. In order to test the potential relevance of this QTL for albuminuria, renal structural alterations and nephron number in MWF we generated the consomic strain MWF-8SHR in which RNO8 from SHR was introgressed into the isogenetic background of MWF. At 8 weeks of age male MWF animals demonstrated an early 55fold increase of UAE compared with SHR males. This early-onset UAE was almost eliminated in consomic MWF- 8SHR. Further time-course analysis of UAE between weeks 8 and 32 revealed a continuous increase in UAE levels of male MWF up to nephrotic range proteinuria (> 150mg/24h). In contrast, consomic MWF-8SHR exhibited only a moderate increase in UAE that was significantly suppressed at all time points investigated. Of interest, nephron number is similar in MWF-8SHR compared to MWF and thus significantly reduced compared to SHR (-36%, p<0.0001). For evaluating renal structural alterations we examined the parameters glomerulosclerosis, tubulointerstitial damage, renal interstitial fibrosis and renal Collagen III mRNA expression. At 24 weeks all parameters were significantly elevated in MWF and consomic MWF-8SHR males compared with SHR. Systolic blood pressure values of consomic MWF-8SHR animals at 14 and 24 weeks were intermediary to values observed in the parental strains. In order to investigate if the influence of RNO8 on UAE is gender dependent we studied female animals of all strains. Compared to female MWF, in female MWF-8SHR the mild increase of UAE with age is significantly diminished at all investigated time points. To analyze the gene dosage effect of the SHR allele on UAE, we studied a group of F1 hybrid rats that were derived from MWF and consomic MWF- 8SHR. The studies showed an incomplete recessive effect on albuminuria. Targeting an effective search for albuminuria-genes on RNO8 we set out to narrow the initial QTL. Therefore we started the breeding of congenic lines derived from the parental stains. Based on these results the target region on RNO8 could be reduced from 30 cM to a 18,6 cM long region.. Our findings demonstrate that at least one gene on RNO8 has crucial influence for the manifestation and progression of albuminuria in MWF rats. While an earlier study suggested a link between suppressed albuminuria and nephron number in consomic MWF-6SHR animals we could show in this study that the influence of the QTL on RNO8 on albuminuria is independent from the nephron deficit in consomic MWF-8SHR animals. Moreover there was no association between renal structural alteration or blood pressure and albuminuria. In spite of a sexual dimorphism in MWF the relevance of the QTL on RNO8 could be validated for both sexes. With our study of the consomic MWF-8SHR strain and congenic lines further identification of genetic factors and molecular mechanisms that lead to chronic kidney diseases can be enabled.