Summary Background: Cancer stem cells (CSCs) represent a subpopulation of cells within tumors that are characterized as the original cells of a tumor which are responsible for tumorigenesis, tumor differentiation, tumor maintenance, metastasis, and tumor relapse following therapy. Increasing evidence suggests that CSCs might at least in part initiate and sustain neoplastic growth and disease progression by suppressing both the innate and adaptive immune systems by a variety of CSC-secreted products and cell- membrane interactions. This will challenge the targeting of these cells by immunotherapy. However, the immunologic properties of CSC are largely unexplored. Methods: In this study, three-dimensional cultures (spheroids) were generated from three cervical cancer cell lines (CaSki, HeLa, and MRIH215) in order to enrich for CSCs. Stemness-related transcription factor expression (Sox2, Nanog, and Oct3/4) and stem cell markers ALDH1, CD44, and CD24 were compared between CSC-enriched spheroid culture-derived cells (SDC) and the corresponding monolayer culture-derived cells (MDC). We evaluated the effect on proliferation, activation and function of SDC or MDC on resting or pre-stimulated T cells in transwell assays. Results: We show that CSC-enriched SDC populations exhibit a higher proportion of ALDH1-expressing cells, ALDH1+CD44+CD24- populations and expression of stem/progenitor cell markers (Sox2, Oct3/4, Nanog) as compared with corresponding MDCs. Moreover, SDCs from cervical cancer cell lines had a stronger suppressive effect on T cell proliferation, activation, cytokine production and cytotoxic T cell effector functions than MDC. The proliferation rate of T cells co-cultured with SDC (ranging from 0.11-11.17%) was significantly less than that of T cells co- cultured with MDC (ranging from 9.91-43.59%). The percentage of activated T cells, according to surface activation markers CD69, CD137, and CD154, when co-cultured with SDC (MFI 15.71-26.33, 21.82-54.62, 12.37-32.6, respectively) was significantly less than those co-cultured with MDC (MFI 23.08-34.82, 34.49-87.79, 15.03-48.39, respectively; P<0.05). The expression of cytokine production of IFN-γ, IL-2, and TNF-α by T cells co-cultured with SDC (MFI 24.55-107.13, 32.67-221.75, 12.24-41.3, respectively) was significantly less than that of T cells co-cultured with MDC (MFI 23.56-152.16, 35.52-252.44, 16.33-48.38, respectively; P<0.05). At effector: target ratios of 10:1, the CMV CTL cytotoxic lysis in the presence of SDC (the relative lysis ranged from 12.46% to 53.8%) was significantly less than the lysis in the presence of MDC (the relative lysis ranged from 19.65% to 60.29%; P<0.05). Conclusion: Consistently, we have found in 3 cervical cancer cell lines a strong immunosuppressive activity exerted by CSC. All T cell functions investigated were suppressed upon co-culture with SDC significantly more strongly than by MDC. This may be an important escape mechanism from immune cells supporting sustained growth of tumors and hampering immune therapeutic strategies.
Zusammenfassung Hintergrund: Krebsstammzellen (CSC, engl.: cancer stem cell) repräsentieren eine Subpopulation von Zellen in Tumoren, die als die Ausgangszellen eines Tumors angesehen werden. Sie werden für Tumorentstehung, Tumordifferenzierung, Tumorerhalt, Metastasierung und Tumorrezidivierung nach der Therapie verantwortlich gemacht. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass CSCs neoplastisches Wachstum und Progression der Erkrankung zumindest teilweise initiieren und aufrecht erhalten, indem sie sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem durch eine Vielzahl von CSC-sezernierten Produkten und Zellen-Membran-Wechselwirkungen supprimieren. Dies wird Immuntherapie dieser Zellen beeinträchtigen. Bisher sind die immunologischen Eigenschaften der CSC noch wenig erforscht. Methode: Für diese Untersuchungen wurden drei-dimensionale Zellkulturen (Sphaeroide) von drei Gebärmutterhalskrebszelllinien (CaSki, HeLa, MRIH215) erzeugt, um CSC anzureichern. Die Expression von Stammzell-Transkriptionsfaktoren (Sox2, Nanog, Oct3/4) und der Stammzellmarker ALDH1, CD44 und CD24 wurden zwischen CSC-angereicherten aus Sphaeroidkultur-abgeleiteten Zellen (SDC: engl.: spheroid culture-derived cells) und den entsprechenden aus Monolayerkultur- abgeleiteten Zellen (MDC: engl.: monolayer culture-derived cells) verglichen. Wir untersuchten die Wirkung von SDC oder MDC auf die Proliferation, Aktivierung und Funktion ruhender oder vorstimulierter T-Zellen in Transwell- Analysen. Ergebnisse: Wir fanden, dass CSC-angereicherte SDC Populationen einen höheren Anteil an ALDH1 exprimierenden Zellen, an ALDH1+CD44+CD24- Populationen und der Expression der Stammzell-/Vorläuferzellmarker (Sox2, Oct3/4, Nanog) im Vergleich zu den entsprechenden MDCs zeigen. Ausserdem hatten SDCs der Gebärmutterhalskrebszelllinien eine stärkere supprimierende Wirkung auf T-Zell-Proliferation, -Aktivierung, -Zytokin-Produktion und zytotoxische T-Zell-Effektorfunktionen als MDC. Die Proliferationsrate der mit SDC ko-kultivierten T-Zellen (zwischen 0,11 bis 11,17%), war statistisch signifikant geringer als diejenige der mit MDC (zwischen 9,91 bis 43,59%) ko- kultivierten T-Zellen. Der Anteil aktivierter T-Zellen, nach Bestimmung der Oberflächenmarkerexpression von CD69, CD137 und CD154, war signifikant geringer wenn sie mit SDC (jeweils MFI 15.71-26.33, 21.82-54.62, 12.37-32.6,) ko-kultiviert worden waren, als diejenige der mit MDC ko-kultivierten (jeweils MFI 23.08-34.82, 34.49-87.79, 15.03-48.39; P<0.05). Die Expression der Zytokinproduktion von IFN-γ, IL-2 und TNF-α war signifikant geringer von den mit SDC (jeweils MFI 24.55-107.13, 32.67-221.75, 12.24-41.3) ko-kultivierten T-Zellen als diejenige der mit MDC ko-kultivierten T-Zellen (jeweils MFI 23.56-152.16, 35.52-252.44, 16.33-48.38; P<0.05). Bei Effektorzell: Zielzell- Verhältnissen von 10:1, war die zytotoxische Lyse durch CMV CTL in Gegenwart von SDC erheblich geringer (zwischen12,46% bis 53,8%) als die Lyse in Gegenwart von MDC (zwischen19,65% bis 60,29%; P<0.05). Zusammenfassung: Wir haben konsistent in 3 Gebärmutterhalskrebszelllinien eine starke immunsuppressive Aktivität gefunden, die durch CSC ausgeübt wurde. Alle untersuchten T-Zell-Funktionen wurden erheblich stärker durch Ko-Kultur mit SDC unterdrückt als durch MDC. Das könnte ein wichtiger Escape-Mechanismus gegen Immunzellen sein, der anhaltendes Wachstum der Tumoren unterstützt und immuntherapeutische Strategien behindert.
