Bedeutung der glomerulären Expression von microRNAs bei der Munich Wistar Frömter-Ratte

Abstract

Die Munich-Wistar-Frömter (MWF) -Ratte ist ein etabliertes Tiermodell für renale Erkrankungen mit Albuminurie. In vorangehenden Arbeiten konnten in genomweiten Kartierungsuntersuchungen mindestens 11 Quantitative Trait Loci (QTL) für die altersabhängige Entwicklung einer Albuminurie bei MWF-Ratten identifiziert werden. Nachfolgend wurde für wichtige QTL auf Rattenchromosom (RNO)6 und RNO8 eine funktionelle Rolle bestätigt. Für ein besseres Verständnis der Rolle von microRNAs (miRNAs) bei der Albuminurieentwicklung wurde die MWF-Ratte als Tiermodell genutzt. MiRNAs sind kurze, nicht- kodierende Abschnitte im Genom, die in der Lage sind, auf posttranskriptioneller Ebene die Expression von Ziel-mRNAs zu beeinflussen. Als Referenzstamm diente die Spontan Hypertensive Ratte (SHR), welche bei systolischen Blutdrücken bis zu 180 mmHg eine geringe, physiologische Albuminurie aufweist. Zur Erfassung differentiell exprimierter miRNAs wurde ein Microarray-Profiling bei MWF- im Vergleich zu SHR-Ratten durchgeführt. Für die Analysen wurde miRNA aus isolierten Glomerulipräparaten der 8. und 24. Woche zwischen MWF- und SHR-Ratten vergleichend untersucht. Die Bestätigung der identifizierten miRNAs erfolgte über quantitative Realtime-PCR, bei der miRNAs mit einer signifikant unterschiedlichen Expression im Zeitverlauf und zwischen den Stämmen analysiert wurden. In einem ersten Screening-Experiment wurden im Glomerulum der MWF- und SHR-Ratte 16 differentiell exprimierte miRNAs identifiziert, die im Zeitverlauf zwischen MWF- oder SHR-Ratten signifikant unterschiedliche Expressionsmuster zeigten. Nachfolgend konnten 15 miRNAs über eine Validierungsanalyse konfirmiert werden. Von diesen zeigten miR-21, miR-29b, miR-200a, miR-204 und miR-301a im Altersverlauf bei MWF oder SHR einen signifikanten Expressionsanstieg bzw. -abfall im Vergleich zu gleichbleibenden und damit altersunabhängigen Expressionsspiegeln des jeweils kontrastierenden Stamms. Für miR-15b, miR-106b, miR-192, miR-194, miR-497 und let-7i wurden bei jeweils beiden Stämmen sich gleichsinnig verändernde Expressionsspiegel im Zeitverlauf ermittelt, wobei sich die Differenz der Expression zwischen beiden Stämmen der einzelnen miRNAs signifikant unterschiedlich darstellte. MiR-29a, miR-29c, miR-150 und miR-347 wiesen eine beim MWF- und SHR-Stamm signifikante Expressionveränderung im Zeitverlauf auf, wobei kein Unterschied zwischen den Stämmen vorlag. Interessanterweise kartieren miR-204 und miR-106b in Albumiurie-QTL auf RNO1 bzw. RNO12, wohingegen die restlichen miRNAs außerhalb von Albuminurie-QTL der MWF-Ratte lokalisiert sind. In der vorliegenden Arbeit konnten erstmals spezifische miRNAs in der Niere der MWF-Ratte nachgewiesen werden, die möglicherweise einen Einfluss in der Entwicklung der Albuminurie haben und im Zusammenhang mit Nierenerkrankungen, wie zum Beispiel der renalen Fibrose, stehen. Die Ergebnisse liefern eine gute Basis für weiterführende Studien, um in Zukunft neue Therapieformen für Nierenerkrankungen entwickeln zu können. MiRNAs haben zudem das Potential als diagnostischer Biomarker zur Früherkennung von renalen Erkrankungen eingesetzt zu werden.

The inbred Munich Wistar Frömter (MWF) rat strain is a suitable inbred rat model to study the genetic basis of albuminuria and kidney diseases. At least 11 quantitative trait loci (QTL) for the development of urinary albumin excretion (UAE) have been identified in previous genetic mapping studies. Furthermore, a functional role of important albuminuria QTL on rat chromosome (RNO)6 and RNO8 has been previously confirmed. The MWF model was utilized to analyze the role of microRNAs (miRNAs) in the development of albuminuria. MiRNAs are small, non-coding sequences that post-transcriptionally regulate gene expression by pairing to target-mRNAs, thereby inducing translational repression or mRNA degradation. The Spontaneously Hypertensive Rat (SHR), which develops spontaneous hypertension in early life, served as a reference strain with low UAE. A genome-wide analysis was conducted to detect miRNAs in the kidney with an age-dependent effect on albuminuria development, which map in known QTL or regulate target-mRNAs within the QTL. Microarray profiling was used to detect differentially expressed miRNAs, which were confirmed with quantitative Realtime-PCR. MiRNA was extracted from glomeruli of MWF and SHR rats aged 8 and 24 weeks. Microarray profiling determined 16 differentially expressed miRNAs that show a significantly differential pattern of expression with age between both strains. In total 15 miRNAs were subsequently confirmed with validation analysis. MiR-21, miR-29b, miR-200a, miR-204 und miR-301a show a significant increase or decrease in expression with age in MWF or SHR in comparison to constant levels of expression regarding the respectively contrasting strain. MiR-15b, miR-106b, miR-192, miR-194, miR-497 und let-7i appear to have concordant changes in expression levels with age regarding both strains. However the difference in expression for each strain differs significantly. MiR-29a, miR-29c, miR-150 und miR-347 display significant differences regarding expression levels with age for MWF and SHR, but no significant difference between both strains. MiR-204 und miR-106b appear to map in albuminuria QTL on RNO1 respectively RNO12. For the first time specific miRNAs have been identified in the kidney of MWF rats, that possibly influence the development of albuminuria and are linked to kidney diseases such as renal fibrosis. In the future, a better understanding of pathways and miRNAs regarding kidney diseases could lead to the development of new forms of drug therapy. Furthermore, miRNAs could be utilized as diagnostic biomarkers for early stages of renal diseases.