Untersuchung über die Beteiligung von nicht-selektiven Kationenkanälen am Ammoniaktransport über das Pansenepithel des Rindes

Abstract

Landwirtschaftliche Nutztiere tragen in erheblichen Umfang zur weltweit wachsenden Stickstoffemission in die Umwelt bei. Insbesondere beim Wiederkäuer führen erhebliche Anteile des eingesetzten Futterproteins nicht wie erwünscht zu mehr Fleischansatz und erhöhter Milchproduktion, sondern werden nach fermentativer Aufspaltung zu Ammoniak über die Epithelien des Gastrointestinaltraktes resorbiert, in der Leber energieaufwendig zu Harnstoff entgiftet und nachfolgend über die Niere in die Umwelt ausgeschieden. Unzählige Versuche, durch ruminale Ansäuerung oder Synchronisation der Verfütterung von Kohlenhydraten und Proteinen eine Reduktion der Stickstoffemission zu erzielen, haben nicht zum Durchbruch geführt. In vitro Versuche am Schafspansen belegen, dass Ammoniak nicht alleine durch physikalische Diffusion der ungeladenen Form (NH3) aus dem Pansen entweicht, sondern dass zusätzlich ein Efflux des protonierten Ammonium-Ions (NH4+) erfolgt. Über die beteiligten Mechanismen ist bisher fast nichts bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Resorptionsmechanismen für Ammoniak über das Pansenepithel des Rindes mittels der Patch-Clamp-Technik, Fluxmessungen in der Ussing-Kammer und Messungen mittels pH-selektiver Mikroelektroden näher zu charakterisieren. Im Einzelnen wurden die folgenden Ergebnisse erzielt: \- Ammoniak induzierte einen positiven Kurzschlussstrom über Pansenepithelien des Rindes in der Ussing-Kammer (10 mmol•l-1; *40 mmol•l-1; *p < 0,05, N/n = 8/40). \- Bei Bestimmung des Ammoniak-Fluxes über das intakte Epithel wurden nach einer Fluxdauer von 150 Minuten bei mukosalem Einsatz von 10 mmol•l-1 NH4+ serosal 3,08 ± 0,17 mmol•l-1 NH4+ nachgewiesen. Bei Einsatz von apikal 40 mmol•l-1 NH4+ erhöhte sich die serosal nachgewiesene Menge auf 8,72 ± 0,65 mmol•l-1 NH4+. Dabei kam es zu keiner Alkalinisierung des serosalen pH-Wertes, wie sie bei überwiegendem Efflux von NH3 in die nur gering gepufferte serosale Lösung zu erwarten gewesen wäre (p = 0,18; N/n = 8/40). \- Bei Mikroelektroden-Messungen führte der Ersatz von 40 mmol•l-1 NMDG+ durch eine äquimolare Menge NH4+ sowohl bei einem mukosalen pH-Wert von 6,4 als auch bei 7,4 zu einer signifikanten Steigerung des transepithelialen und apikalen Potentials (pH 6,4: ΔPDt 2,78 ± 0,37 mV; ΔPDa 2,13 ± 0,5 mV; pH 7,4: ΔPDt 2,53 ± 0,46 mV; ΔPDa 1,0 ± 1,8 mV; N/n = 6/12, p < 0,05). Gleichzeitig konnte unter beiden Versuchsbedingungen ein signifikanter Abfall des pHi gemessen werde (pH 6,4: ΔpHi -0,13 ± 0,02; pH 7,4: ΔpHi -0,16 ± 0,05; N/n = 6/12, p < 0,05). Dieses Ergebnis belegt einen transzellulären Effluxmechanismus und deutet weiterhin darauf hin, dass sowohl bei einem pH-Wert in Höhe von 6,4 als auch 7,4 die apikale elektrogene Aufnahme in Form von NH4+ leicht gegenüber der serosalen Abgabe in dieser Form überwiegt. \- Die Leitfähigkeit für NH4+ wurde durch extrazelluläre divalenten Kationen (Ca2+ und Mg2+) blockiert. Dies konnte sowohl in Patch-Clamp Messungen an isolierten Zellen, die mit einer Na- Glukonat oder K-Glukonat Pipettenlösung gefüllt waren (n = 8, p = 0,008 und n = 7, p = 0,016), als auch an intakten Epithelien (Mikroelektrodentechnik) (N/n = 3/4, p = 0,005) gezeigt werden. Verapamil hatte ebenfalls eine hemmende Wirkung (N/n = 3/7, p = 0,008). \- Verschiedene spezifische Modulatoren der TRP-Kanalfamilie hatten einen Einfluss auf den NH4+ induzierten Kurzschlussstrom. So konnte gezeigt werden, dass Menthol (200 μmol/l; 1 mmol/l) zu einer transienten Steigerung des Isc über das Epithel führte (ΔIsc 5,35 ± 0,97 μA•cm-2; N/n = 4/11, p = 0,02 bzw. ΔIsc 4,53 ± 0,94 μA.cm-2; N/n = 3/12, p = 0,022). Capsaicin (100 μmol•l-1) führte dagegen zu einer signifikanten Hemmung dieses Kurzschlussstroms (ΔIsc -3,25 ± 1,16 μA•cm-2; N/n = 4/6, p = 0,02). Die Applikation von Thymol (100 μmol•l-1 und 1 mmol•l-1) hatte ebenfalls einen deutlichen, wenn auch stark vom individuellen Epithel abhängigen Effekt auf den NH4+ induzierten Kurzschlussstrom (N/n = 2/4 und N/n = 6/9). Eine Applikation von Lösungsmittel ohne Agonist blieb hingegen ohne Effekt (N/n = 3/6). Auch an Epithelien von Schafen waren entsprechende Effekte nachweisbar. \- Da der apikale Ersatz von Chlorid durch Glukonat zu einer Hyperpolarisation des apikalen Potentials führte, dürften die in Zellen des Pansenepithels nachweißbaren Anionenkanäle basolateral exprimiert werden. Eine Beteiligung an den durch TRP-Modulatoren auslösbaren Stromantworten erscheint daher unwahrscheinlich. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse auf die Beteiligung von nicht-selektiven Kationenkanälen der TRP-Familie am Efflux von Ammoniak aus dem Pansen hin. Eine mögliche Beteiligung dieser Kanäle am Efflux von Protonen aus dem Pansen im Sinne der intraruminalen pH-Homöostase wird diskutiert. Eine gezielte Beeinflussung des Ammoniumtransportes aus dem Pansen des Rindes durch Züchtung oder dem Einsatz entsprechender Modulatoren erscheint möglich.

The impact of the livestock industry on the globally increasing emissions of nitrogen is profound. Particularly in ruminants, a large percentage of the protein that is fed does not lead to the desired increases in meat and milk production, but is microbially broken down into ammonia, absorbed across the epithelia of the gastro-intestinal tract, hepatically converted into urea in an energy-consuming process and finally emitted into the environment via the kidney. Countless studies attempting to reduce nitrogen emissions by ruminal acidification or synchronisation of the carbohydrate and protein content of the diet have not resolved this issue. In vitro studies on the sheep rumen show that epithelial efflux of ammonia does not only involve simple diffusion of the uncharged form (NH3), but also a transport of the protonated ammonium ion (NH4+). So far, there is very little information on the underlying mechanisms. The aim of the present study was to characterize the mechanisms for the absorption of ammonia across the bovine ruminal epithelium using the patch-clamp-technique, flux studies in the Ussing chamber and pH-selective microelectrodes. The experiments yielded the following results: \- The absorption of ammonia across the ruminal epithelium of cows induced a positive short-circuit current in the Ussing chamber (10 mmol·l-1; *40 mmol·l-1 *p < 0.05). \- A 2.5-hour incubation in the Ussing chamber exposing the mucosal side of the tissue to 10 mmol·l-1 NH4Cl led to a serosal concentration of 3.08 ± 0.17 mmol·l-1 NH4+. Increasing the mucosal concentration to 40 mmol·l-1 NH4Cl resulted in an increased serosal concentration of 8.72 ± 0.65 mmol·l-1 NH4+. No significant alkalinization of the only lightly buffered serosal solution was observed, as should have been the case if NH3 were the primary form transported (p = 0.18; N/ n = 8/40). \- In microelectrode measurements, the replacement of 40 mmol·l-1 NMDG+ by an equimolar amount of NH4+ (pH 6.4 and 7.4) resulted in a significant depolarization of the transepithelial and apical potential (pH 6.4: ΔPDt 2.78 ± 0.37 mV; ΔPDa 2.13 ± 0.5 mV; pH 7.4: ΔPDt 2.53 ± 0.46 mV; ΔPDa 1.0 ± 1.8 mV N/n = 6/12, p < 0.05). Simultaneously the intracellular pH dropped significantly at both values of pH (pH 6.4: (ΔpHi -0.13 ± 0.02; pH 7.4: (ΔpHi -0.16 ± 0.05; N/n = 6/12, p < 0.05). These results suggest a transcellular pathway. The acidification observed also implies that the apical influx of NH4+ slightly exceeded the basolateral efflux at pH 6.4 as well as 7.4. \- The NH4+ conductance of the ruminal epithelium was blocked by divalent cations (Ca2+ and Mg2+). This was shown in patch clamp measurements of isolated cells filled with Na-gluconate solution or K-gluconate solution (n = 8, p = 0.008 and n = 7, p = 0.016), as well as in intact epithelia measured in the Ussing Chamber (microelectrode-technique) (N/n = 3/4, p = 0.005). Verapamil (1 mmol·l-1) had an inhibitory effect (N/n = 3/7, p = 0.008). \- Various specific modulators of the TRP-channel-family had an effect on the NH4+ induced current. The mucosal application of menthol (200 μmol·l-1; 1 mmol·l-1) resulted in a clear but transient increase of Isc (ΔIsc 5.35 ± 0.97 μA•cm-2 (N/n = 4/11, p = 0.02) and ΔIsc 4.53 ± 0.94 μA•cm-2 (N/n = 3/12, p = 0.022), respectively). In contrast, the application of capsaicin (100 μmol·l-1) led to a significant decrease of the transepithelial current (ΔIsc -3.25 ± 1.16 μA•cm-2, N/n = 4/6, p = 0.02). Thymol (100 μmol·l-1 and 1 mmol·l-1) showed clearly visible effects on the NH4+ induced current, although with great variability depending on the tissue studied (N/n = 2/4 and N/n = 6/9). The application of the solvent alone had no effect (N/n = 3/6). Similar effects could be demonstrated on ovine ruminal epithelium. \- Apical replacement of chloride by gluconate led to a hyperpolarization of the apical potential, suggesting a basolateral localisation of the anion-channels expressed by ruminal epithelial cells. A participation of these channels in the currents induced by TRP-modulators appears unlikely. In summary, the results suggest an involvement of non-selective cation channels belonging to the TRP-family in the efflux of ammonia from the rumen. A participation of these channels in the efflux of protons across the ruminal epithelium to maintain pH-homeostasis is discussed. A targeted manipulation of ammonium transport across the ruminal epithelium of cows through breeding or the application of TRP-channel modulators appears possible.