The protein VASP is important for the regulation of actin dynamics. It prevents the inhibition of filament growth (capping). This process is important for shape changes and migration of cells. VASP is also involved in infections with the pathogenic bacterium Listeria monocytogenes and is recruited to the bacterium�s surface. This allows Listeria to polymerise actin filaments and propel itself through the cell. The interaction of VASP is mediated by the surface protein ActA, which contains the amino acid sequence motif SFEFPPPPTEDEL. VASP does not contain a catalytic subunit but rather is involved in several protein protein interactions. They are mediated by the N-terminal EVH1 domain, a central proline rich region and an F-actin binding domain. VASP oligomerises via its C-terminal coiled coil domain. It was the main goal of this work to gain a detailed understanding of factors influencing the function of VASP and develop means to influence this function. The focus lay on investigating the EVH1 domain, competitive inhibitors containing nonnatural amino acids were developed. These allow for an extension of structural motifs compared to natural amino acids and are less prone to proteolytic digestion in vivo. The interaction of VASP with proline rich motifs is mediated by its EVH1 domain. It binds sequences containing the sequence motif FPxfP. It is not possible to substitute the two proline residues with any other natural amnio acid. The only substitution leading to a ligand of higher affinity is SFEWPPPPTEDEL. In this work new ligands based on peptoidic building blocks were developed for the VASP EVH1 domain. These building blocks are derived from the rare amino acid sarcosin, bearing two hydrogen atoms on Ca and a sidechain on the nitrogen atom. Starting from the peptide SFEFPPPPTEDEL a new ligand was developed by screening and model supported structure optimization, in which the first proline residue as well as the preceeding Phe residue were substituted. The peptomer SFEAXPPPPTEDEL (X: peptoid building block) has a lower affinity compared to the starting ligand, but proves the validity of this method in the development of EVH1 ligands. For a better understanding of the structure-function-relationship of EVH1 domains the investigation of homologous proteins is very useful. Therefore the structure of the sequence homologous EVH1 domain from the human Spred2 protein was determined. The structure confirmed the sequence based assumption that this is indeed an EVH1 domain. A comparison of the putative binding site to that of other EVH1 domains shows considerable differences and hints at a different ligand specificity. An interaction partner for the Spred2 EVH1 domain has not been identified in the literature so far. The affinity of EVH1 domains to their binding partners is low, hence the oligomerization of VASP plays a central role in increasing interactions with target proteins. Hence the C-terminal coiled coil EVH2 domain of VASP was investigated as a modulating factor of VASP function. Combining analytical ultracentrifugation and NMR spectroscopy it has been possible to show that this domain forms a parallel tetramer over a broad concentartion range (0.0625 - 5.0 mM). Insight into this arrangement is crucial in developing models of VASP fucntion and interaction within protein networks. Due to the high degree of symmetry of the coiled coil domain is was not possible to determine the complete tetramer structure by NMR so far. Based on NOESY data and residual dipolar couplings a model of a monomer has been calculated. This model is in reasonable agreement with the recently solved crystal structure.
Bei der Regulation der Dynamik des Aktincytoskeletts spielt das Protein VASP eine wichtige Rolle. Es verhindert das Capping (Wachstumshemmung) der Aktinfilamente. Dieser Vorgang spielt bei Formänderungen und Migration von Zellen eine wesentliche Rolle. Weiterhin wird VASP bei Infektionen mit dem pathogenen Bakterium Listeria monocytogenes an dessen Oberfläche rekrutiert. Das ermöglicht es Listeria, Aktinfilamente zu polymerisieren und sich so durch die Zelle fortzubewegen. Diese Wechselwirkung wird über das Protein ActA an der Oberfläche von Listeria vermittelt, welches das Motiv SFEFPPPPTEDEL enthält. VASP ist ein Protein ohne katalytische Untereinheiten, das verschiedene Protein-Protein-Wechselwirkungen eingeht. Diese werden von der N-terminalen EVH1-Domäne, einem prolinreichen Mittelteil und einer darauffolgenden F-Aktin bindenden Domäne geformt. Über eine C-terminale coiled coil EVH2-Domäne oligomerisiert VASP. Ziel dieser Arbeit war ein strukturelles Verständnis der Faktoren, die zur Funktion von VASP beitragen, und die Entwicklung von Wegen zu deren Beeinflussung. Das Hauptgewicht lag auf der Untersuchung der EVH1-Domäne, für die kompetitive Liganden mit nicht- natürlichen Aminosäuren entwickelt wurden. Diese erlauben eine Erweiterung des Strukturrepertoires gegenüber natürlichen Aminosäuren und sind in vivo weniger anfällig für einen proteolytischen Abbau. Die Wechselwirkung von VASP mit prolinreichen Motiven, wie sie etwa in ActA vorliegen, wird über die N-terminale EVH1 Domäne vermittelt. Sie bindet Sequenzen des Typs FPxfP. Es hat sich als unmöglich herausgestellt, die beiden Proline dieser Sequenz durch andere, natürliche Aminosäuren zu ersetzen. Die einzige Substitution, die zu einem Liganden höherer Affinität führt, ist SFEWPPPPTEDEL. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Liganden für die humane VASP EVH1-Domäne auf der Basis von Peptoidbausteinen entwickelt. Diese Bausteine sind von der seltenen Aminosäure Sarcosin abgeleitet. Sie tragen an Ca zwei Wasserstoffatome und eine Seitenkette am Stickstoffatom. Ausgehend von dem Peptid SFEFPPPPTEDEL konnte durch ein Screening und anschließende modellunterstützte Optimierung der Strukturen ein neuer Ligand entwickelt werden, in dem sowohl der erste Prolinrest als auch der vorangehende Phenylalaninrest ersetzt wurden. Das Peptomer mit der Sequenz SFEAXPPPTEDEL (X: Peptoidbaustein) hat zwar eine geringere Affinität für die VASP EVH1-Domäne im Vergleich zum Ausgangsliganden, belegt aber den Wert der Methode für die Entwicklung von Liganden für EVH1-Domänen. Um ein besseres Verständnis der Struktur-Funktions- Beziehung der EVH1-Domänen zu erlangen, ist die Untersuchung homologer Domänen hilfreich. Daher wurde die Struktur der sequenzhomologen EVH1-Domäne aus dem humanen Protein Spred2 aufgeklärt. Die Struktur bestätigte die Annahme aus dem Sequenzvergleich, dass es sich in der Tat um eine EVH1-Domäne handelt. Ein Vergleich der möglichen Bindestelle dieser Domäne mit der Bindestelle bekannter EVH1-Domänen deutet darauf hin, dass die Spred2 EVH1-Domäne eine andere Ligandenspezifität hat. Interaktionspartner für diese Domäne wurden bisher nicht beschrieben. Die Affinitäten von EVH1-Domänen zu ihren Bindungspartnern sind niedrig, daher spielt die beobachtete Oligomerisierung von VASP eine Rolle zur Steigerung der Bindung an Zielproteine. Aus diesem Grund wurde die C-terminale EVH2-Domäne von VASP als modulierender Faktor untersucht. Durch die Kombination von Analytischer Ultrazentrifugation und NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, das die Domäne über einen weiten Konzentrationsbereich (0,0625 - 5,0 mM) als parallels Tetramer vorliegt. Diese Anordnung ist wesentlich für die Entwicklung von Modellen zur Funktion des Proteins VASP und insbesondere der Wechselwirkung seiner EVH1-Domäne mit anderen Proteinen. Aufgrund der hohen Symmetrie des coiled coil Domäne konnte ihre Gesamtstruktur durch NMR-Spektroskopie bisher nicht aufgeklärt werden. Auf der Basis der vorliegenden Daten aus NOESY-Experimenten und der Auswertung von Residualen Dipolaren Kopplungen wurde ein Modell des Monomers berechnet, das recht gut mit der in der Zwischenzeit aufgeklärten Kristallstruktur des Tetramers übereinstimmt.
