Role of the Marek’s disease virus (MDV) interleukin-8 (vIL-8) in lymphoma formation and recruitment of target cells

Abstract

Marek’s disease virus (MDV) is a cell-associated and highly oncogenic alpha- herpesvirus that infects chickens. The MDV genome consists of a unique long (UL) and a unique short region (US), each flanked by inverted repeat regions (RL, RS). In the RL, a number of unique genes are located that are involved in MDV pathogenesis and tumorigenesis. To facilitate generation of recombinant viruses harboring mutations in the MDV RL region, I deleted most of the internal repeat long (IRL) in pRB-1B (vΔIRL) leaving short sequence ends of the region intact to allow restoration of the sequence via homologous recombination during MDV replication. I used vΔIRL as a tool to modify the viral interleukin-8 (vIL-8), a CXC chemokine expressed during both the lytic and latent stages of MDV infection to investigate its role in MDV pathogenesis. Previously, a virus with a deletion of the entire vIL-8 open reading frame (ORF) was shown to be severely impaired in disease progression and tumor development in infected chickens. Marek’s disease (MD) and tumor incidence was reduced to 4-10% in chickens infected with vIL-8 deletion viruses compared to more than 90% upon infection with parental virus. However, it remained unclear whether this phenotype was caused by the lack of secreted vIL-8 or vIL-8 splice variants that fuse exons II and III of vIL-8 to several upstream open reading frames, including the viral oncoprotein Meq, RLORF4 and RLORF5a. To specifically examine the role of secreted vIL-8 in MDV pathogenesis, I constructed a recombinant virus in which the vIL-8 start codon located in exon I was mutated (vΔMetvIL- 8). This mutant lacked expression of vIL-8 without affecting Meq-vIL-8 splice variants. Loss of secreted vIL-8 resulted in a highly reduced disease and tumor incidence in chickens infected with vΔMetvIL-8 by the intra-abdominal route. Although vΔMetvIL-8 was still able to spread to naïve animals via the natural route, infection and lymphomagenesis in contact animals was severely impaired. To determine the target cells of the vIL-8 chemokine, I generated purified recombinant vIL-8 and could demonstrate that it efficiently binds to and induces chemotaxis of B cells, the main target for lytic MDV replication. Furthermore, I could show that vIL-8 also interacts with CD4+CD25+ T cells, a putative target for MDV transformation. Our data provide evidence that vIL-8 attracts B cells and CD4+CD25+ T cells the targets for both lytic and latent infection. Chemokines usually contain a number of conserved motifs that are important for chemokine function. vIL-8 contains a DKR motif at the N-terminus. In other CXC chemokines, the motif in this position is responsible for the specific binding of the chemokine to its receptor on target cells. To address the role of the DKR motif in the binding specificity, I mutated the DKR motif to ELR which is present in the closely related chemokine interleukin-8 (IL-8). Mutating the DKR motif to ELR did not alter the binding properties of vIL-8 suggesting that DKR is not important for specificity of vIL-8 binding. Previously, a role for C-terminal domains of CXC cytokines in angiogenesis during tumor formation has been suggested. To determine whether the vIL-8 C-terminus can influence tumor formation, I generated a C-terminal deletion mutant (vΔCT-vIL-8). In vitro, this virus replicated comparable to parental and revertant virus. In vivo, we only observed only a slight reduction in disease and tumor incidence in chickens infected with vΔCT-vIL-8, suggesting that the C-terminus plays a minor role in the tumorigenesis and pathogenesis and neither affects vIL-8 nor vIL-8 splice variant function. Despite a plethora of studies addressing the establishment of MDV infection and pathogenesis, the exact mechanisms are still not well understood. To develop a tool that facilitates detection of and discrimination between lytic and latently infected cells in vivo, we generated a markervirus containing fluorescently labeled proteins indicating the state of the infection of the infected cells. For this purpose, we fused the red fluorescent protein (RFP) to the C-terminus of UL47, a protein expressed only during lytic replication, and the green fluorescent protein (GFP) to the C-terminus of Meq, a protein expressed during latency and in transformed cells (vUL47-RFP_Meq-GFP). In vitro, vUL47-RFP_Meq-GFP replicated comparable to parental virus and expression of the fluorescent proteins could be observed. Intriguingly, vUL47-RFP_Meq-GFP did not induce disease, suggesting that fusion of GFP to the C-terminus of Meq affects its function in transformation and tumorigenesis.

Das Marek’s disease Virus ist ein zellassoziiertes, onkogenes Alphaherpesvirus, das Hühner infiziert. Das MDV-Genom besteht aus Genomabschnitten, die als unique long (UL) und unique short regions (US) bezeichnet, und jeweils von invertierten, homologen repeats (RL, RS) eingerahmt werden. Innerhalb der RL befinden sich diploide Gene, die spezifisch für MDV sind, und für die in vielen Studien eine wichtige Rolle in der Pathogenese und Tumorigenese der Marek’schen Krankheit gezeigt wurde. Um das Erstellen von rekombinanten Viren im Bereich der RL zu vereinfachen, habe ich den Großteil des internal repeat long (IRL) entfernt, wobei kurze Endsequenzen des IRL im Virusgenom verblieben sind, die die Wiederherstellung der Sequenz durch homologe Rekombination während der Replikation ermöglichen. Dieses ΔIRL Virus bildet die Grundlage, um die Rolle des viralen Interleukin-8 (vIL-8), einem CXC Chemokin, in der MDV Pathogenese zu untersuchen, das sowohl während der lytischen als auch der latenten Infektion in Zellen exprimiert wird. Bisherige Studien zeigten, dass nach Infektion mit einer vIL-8 Deletionsmutante, bei der der gesamte open reading frame (ORF) entfernt wurde, Tumor- und Marek’s Disease Inzidenz nur noch bei 4-10% gegenüber mehr als 90% bei Hühnern, die mit dem hoch pathogenen, parentalen Virusstamm RB-1B infiziert wurden, lagen. Es blieb jedoch unklar, ob dieser Phänotyp des vIL-8 Deletionsvirus auf die fehlende vIL-8 Sekretion oder auf den Verlust von vIL-8 splice Varianten zurückzuführen ist, bei denen die Exons II und III von vIL-8 an einige andere Gene, wie etwa das virale Onkoprotein Meq, RLORF4, oder RLORF5a gespleißt werden. Um deshalb die Rolle des sekretierten vIL-8 für die Pathogenese zu untersuchen, habe ich ein rekombinantes Virus, vΔMetvIL-8, erstellt, bei dem das in Exon I enthaltene Startcodon mutiert ist. Dieser Mutante fehlt die vIL-8 Expression, lässt aber die Expression von vIL-8 Spleißvarianten unberührt. In vivo führte die fehlende vIL-8 Sekretion zu einer stark reduzierten Marek’s Disease und Tumorinzidenz nach intra abdominaler Infektion. Obwohl vΔMetvIL-8 Viren noch auf naive Hühner auf dem natürlichen Infektionsweg übertragbar waren, verursachte das Virus jedoch keine Krankheitssymptome oder Lymphome in den Kontakttieren. In in vitro Assays mit aufgereinigtem, rekombinantem vIL-8 band effektiv an B Zellen, in denen MDV lytisch repliziert und induzierte Chemotaxis. Außerdem interagierte vIL-8 auch mit CD4+CD25+ T Zellen, die das Virus möglicherweise für die Transformation nutzt. Diese Daten sprechen daher dafür, dass vIL-8 B Zellen und möglicherweise CD4+ CD25+ T Zellen mit aktiviertem Phänotyp und für die lytische und latent Infektion rekrutiert. Chemokine besitzen eine Reihe an konservierten Motiven, die für die Chemokinfunktion von Bedeutung sind. vIL-8 hat ein DKR Motiv am N-Terminus, und es wurde für andere Chemokine gezeigt, dass das Aminosäuremotiv an dieser Stelle für das spezifische Binden des Chemokins an seinen Rezeptor verantwortlich ist. Um die Rolle des DKR Motivs für die Bindungsspezifität zu bestimmen, mutierte ich DKR zu ELR, das im nahe verwandten Interleukin-8 (IL-8) zu finden ist. Die Mutation zu ELR veränderte jedoch die Bindungseigenschaften von vIL-8 nicht, was darauf hinweist, dass DKR für die Bindungsspezifität keine Rolle spielt. In früheren Studien wurde außerdem eine Rolle für die C-terminale Domäne von CXC Chemokinen für die Angiogenese während der Tumorentstehung vorgeschlagen. Um zu sehen, ob der C-terminus von vIL-8 möglicherweise einen ähnlichen Einfluss auf die Tumorentstehung hat, stellte ich eine C-terminale Deletionsmutante her (vΔCT- vIL-8). In vitro replizierte dieses Virus vergleichbar mit dem parentalen Virus. In vivo beobachtete ich jedoch nur eine geringfügige Reduktion an Erkrankungen und Tumoren, was darauf hindeutet, dass der C-terminus nur eine untergeordnete Rolle bei der Tumorigenese spielt und weder für vIL-8 noch für vIL-8 Spleißvarianten eine herausragende Bedeutung hat. Trotz einer Vielzahl von Studien, die die Etablierung der MDV Infektion und Pathogenese Untersuchen, sind die genauen Mechanismen noch unzureichend verstanden. Um ein Hilfsmittel für die Detektion und Differenzierung von lytisch und latent infizierten Zellen zu entwickeln, erstellte ich ein rekombinantes Virus mit fluoreszierenden Virusproteinen, die den Infektionsstatus einer infizierten Zelle ablesen lassen. Zu diesem Zweck habe ich red fluorescent protein (RFP) an den C-terminus von UL47 fusioniert, einem Protein, das nur während der lytischen Replikation exprimiert wird; und green fluorescent protein (GFP) an den C-terminus von Meq, einem Protein, das währen der Latenz und in transformierten Zellen gebildet wird (vUL47-PRF_Meq-GFP). In vitro replizierte vUL47-PRF_Meq- GFP vergleichbar mit dem parentalen Virus und die Expression der fluoreszierenden Proteine konnte beobachtet werden. Interessanterweise verursachte vUL47-PRF_Meq-GFP keine MD, was darauf hindeutet, dass durch die Fusion von GFP and Meq dessen Funktion in der Transformation und Tumorigenese stark beeinträchtigt wird.