Chondrogenes Differenzierungspotential mesenchymaler Stammzellen in hochdichten 3D-Kulturen und im bioresorbierbaren Polymer-Vlies

Abstract

Mesenchymale Stammzellen (MSC) haben das Potential sich zu mesenchymalen Geweben zu differenzieren. Sie bieten sich daher als interessante Zellquelle für Ansätze des Tissue engineerings im Knorpelbereich an. Unser Ziel war es, die Effekte von TGF-ß1, Hyaluronsäure (HA) und Synovialflüssigkeit (SF) auf die chondrogene Differenzierung equiner MSC in hochdichten 3D-Kulturen als auch im bioresorbierbaren Polymer-Vlies zu studieren. Dafür wurde Knochenmark aus der Tibia von zwei 18 Monate alten Pferden gewonnen (Haflinger). Die MSC wurden mittels Zentrifugation über einen Percolldichtegradienten isoliert. Für die Chondrogenese in hochdichten 3-D-Kulturen wurden MSC zu Pellets zentrifugiert und in einem Medium kultiviert welches 10 ng/ml TGFß-1 oder 0,1 mg/ml HA (Hylartil®, Ostenil®) oder entweder 5%, 10% oder 50% autologe SF als Chondrogenese induzierenden Faktor enthielt. Im bioresorbierbaren Polymer- Vlies wurden entweder 10ng/ml TGF-ß1 oder 5% autologe SF als Chondrogenese induzierender Faktor genutzt. Chondrogene Differenzierung wurde über die Expression von Kollagen Typ-II und Proteoglycan nachgewiesen. In hochdichten 3D-Kulturen zeigten mit TGF-ß1 induzierte MSC die höchste Proteoglycan- Expression. Die Kombination von TGF-ß1 mit HA zeigte keinen synergistischen Effekt. Kulturen, die nur mit SF (unabhängig von der Konzentration) oder nur mit HA stimuliert wurden, zeigten eine deutliche, aber niedrigere Proteoglycan-Expression als die mit TGF-ß1 stimulierten Kulturen. Die Expression von Kollagen Typ II war in allen stimulierten Kulturen vergleichbar hoch. Im bioresorbierbaren Vlies zeigten MSC sowohl unter TGF-ß1 als auch unter autologer SF die Fähigkeit, extrazelluläre Matrix zu bilden, die reich an Proteoglycanen war und zu einem festen, knorpelartigen Vlies-Zell-Integrat führte. Mit autologer SF induzierte MSC zeigten dabei eine homogenere Verteilung von Zellen und extrazellulärer Matrix im Vlies als bei TGF-ß1 induzierten MSC, wo sich die Zellen und die extrazelluäre Matrix mehr an der Oberfläche des Vlieses fanden. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass HA und SF Chondrogenese bei equinen MSC induzieren können. Dies ermutigt zu Anwendungen des Tissue engineering mit MSC bei chondralen Defekten, da die natürliche Umgebung im Gelenk der chondrogenen Differenzierung förderlich ist.

Mesenchymal stem cells (MSC) have the potential to differentiate into distinct mesenchymal tissues including cartilage, which suggests these cells as an attractive cell source for cartilage tissue engineering approaches. Our objective was to study the effects of TGF-ß1, hyaluronic acid (HA) and synovial fluid (SF) on chondrogenic differentiation of equine MSC in high- density-3D-cultures as well as in bioresorbable polymer fleece. For that objective, bone marrow was aspirated from the tibia of two 18-month-old horses (Haflinger) and MSC were isolated using percoll-density centrifugation. To promote chondrogenesis in high-density-3D-cultures, MSC were centrifuged to form a micromass and were cultured in a medium containing 10 ng/ml TGF-ß1 or 0.1 mg/ml HA (Hylartil®, Ostenil®), or either 5%, 10% or 50% autologous SF, as the chondrogenesis inducing factor. In the bioresorbable polymer fleece either 10 ng/ml TGF-ß1 or 5% autologous SF were used as the chondrogenesis inducing factor. Differentiation along the chondrogenic lineage was documented by type II collagen and proteoglycan expression. In high-density-3D-cultures, MSC induced by TGF-ß1 alone showed the highest proteoglycan expression. Combining TGF-ß1 with HA could not increase the proteoglycan expression. Cultures stimulated by autologous SF (independent of concentration) or HA demonstrated a pronounced, but lower proteoglycan expression than cultures stimulated by TGF-ß1. The expression of cartilage-specific type II collagen was high and nearly the same in all stimulated cultures. In the bioresorbable polymer fleece, MSC induced either with TGF-ß1 or autologous SF showed the ability to produce extracellular matrix, rich in proteoglycans, resulting in a stiff, cartilage-like fleece-cell integrate. MSC induced with autologous SF showed a more homogeneous distribution of cells and extracellular matrix within the fleece than when induced with TGF-ß1, where cells and extracellular matrix were found more on the surface area of the fleece. In summary, HA and autologous SF induce chondrogenesis of equine MSC, which strongly suggests tissue engineering applications of MSC in chondral defects, as the natural environment in the joint is favorable for chondrogenic differentiation.