dc.contributor.author
Heisler, Helma
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:43:17Z
dc.date.available
2003-03-03T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8317
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12516
dc.description
0 Titelblatt, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Material
3 Methoden
4 Ergebnisse
5 Diskussion
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literatur
9 Anhang
Publikationen
Lebenslauf
Danksagung
dc.description.abstract
RNA-Editing in Pflanzen führt zur Veränderung von Cytidinen zu Uridinen (C zu
U) in mitochondrialen und plastidären Transkripten. Um dieses Phänomen besser
verstehen und die an dieser Modifikationsreaktion beteiligten Faktoren
identifizieren zu können, wurden bereits in vivo-, sowie in organello- und in
vitro-Systeme entwickelt, die jedoch sehr zeitaufwendig sind oder nur geringe
Editingaktivität zeigen. Von zentraler Bedeutung bei der Untersuchung des RNA-
Editings in vitro ist daher die Sensitivität des Nachweissystems. Die in der
vorliegenden Arbeit entwickelte Detektionsmethode, die Primer-Ligation, mit
der ein C zu U-Umsatz von deutlich unter 1 % nachgewiesen werden konnte,
beruht auf einer Ligationsreaktion, die zwei mit dem Editingsubstrat gepaarte
Oligonucleotide bei vollständiger Komplementarität an der Editingstelle
spezifisch miteinander verknüpft. Mit dieser neuen Methode gelang es,
zuverlässige mitochondriale und plastidäre in vitro-RNA-Editingsysteme zu
etablieren, die sogar bis zu 5 % RNA-Editingaktivität aufwiesen. Dabei zeigte
das mitochondriale Erbsensystem ebenso heterologes RNA-Editing wie
Kartoffelmitochondrien in einem zusätzlich etablierten in organello-System an
den zwischen der Erbse und der Kartoffel konservierten Editingstellen der
atp9-RNA. Für diese mitochondriale RNA konnte darüberhinaus in einem
plastidären Erbsen-in vitro-System organellenheterologes Editing nachgewiesen
werden, sodaß nicht nur Mitochondrien, sondern offensichtlich auch
Chloroplasten über die essentiellen Komponenten des atp9-RNA-Editings
verfügen. Zur Analyse der genauen Sequenzanforderungen an das Editingsubstrat
wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kompetitionsanalyse entwickelt, die
Desoxyoligonucleotid-Kompetitoren zur Hybridisierung an die RNA nutzt, um die
Interaktion mit potentiellen Editingfaktoren zu verhindern. Mit Hilfe dieser
neuen Methode ist es erstmalig gelungen, für das atp9-RNA-Editing ein
essentielles cis-Element im nahen Upstreambereich der Editingstelle 1 zu
identifizieren. Für das 10 Nucleotide umfassende Element konnte über "Linker
Scanning"-Mutagenese nicht nur die Lage bestätigt, sondern darüberhinaus im in
vitro- sowie im in organello-System erstmalig direkt gezeigt werden, daß der
Abstand zur Editingstelle ("Spacing") selbst von zentraler Bedeutung für die
Editingreaktion ist. Gleichzeitig zeigte die Analyse der
atp9-Insertionsmutanten, daß die C zu U-Umwandlung der Editingstelle 2
unabhängig von der Editingstelle 1 determiniert wird. Durch die vorliegende
Arbeit ist nun die Grundlage geschaffen, die Regulation des RNA-Editings über
die Identifzierung von cis-Elementen und potentieller trans-Faktoren aufklären
und die Entstehung dieses enigmatischen Prozesses besser verstehen zu können.
de
dc.description.abstract
RNA editing in mitochondrial and plastidic transcripts of plants results in
the modification of cytidines to uridines (C to U). In vivo, in organello and
in vitro systems have been already established to better understand this
phenomenon and to identify factors involved in this modification reaction.
Nevertheless, they are either time consuming or show only low editing activity
so that it is very important to have a very sensitive detection system for
investigating RNA editing in vitro. The here developed assay, the primer
ligation, can detect less than 1 % C to U editing. It is based on the
annealing of two oligonucleotides to the editing substrate and a following
ligation if perfectly matched at the editing site. Via this method reliable
mitochondrial and plastidic in vitro RNA editing systems could be established
with editing activities of up to 5 %. The mitochondrial pea system showed
heterologous RNA editing at the conserved sites of the atp9 RNA, as did the
mitochondria from potato in an additionally established in organello system.
Furthermore, for this mitochondrial RNA organell-heterologous editing also
could be shown in a pea plastidic in vitro system suggesting that not only
mitochondria but also chloroplasts contain all essential factors for the atp9
RNA editing. To exactly determine the sequence requirements in the editing
substrate a competition analysis was developed which uses the hybridization of
deoxynucleotide competitors to the RNA to inhibit the interaction with
possible editing factors. With the help of this method an essential cis-
element for atp9 RNA editing was identified for the first time in the upstream
region of the editing site 1. Via linker scanning mutagenesis the position of
this 10 nucleotide spanning element could be confirmed. Furthermore, the
analysis of the insertion mutants showed in in vitro as well as in in
organello systems that the distance (spacing) of the element to the editing
site 1 is essential whereas the C to U conversion at the editing site 2 is
performed independently. In this work the foundation has been laid for
elucidating the regulation of RNA editing by identifying cis-elements and
possible trans-factors and to better understand the origin of this still
enigmatic process.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
plant organelles
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Untersuchung des RNA-Editings in Pflanzenorganellen: Entwicklung eines
Verfahrens zur Identifizierung von cis-Elementen am Beispiel der atp9-RNA in
in vitro- und in organello-Systemen
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Thomas Schmülling
dc.contributor.furtherReferee
Priv.-Doz. Dr. Wolfgang Schuster
dc.date.accepted
2003-02-11
dc.date.embargoEnd
2003-03-05
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003000542
dc.title.translated
Investigation of RNA editing in plant organelles: development of a technique
to identify cis-elements for atp9 RNA as model in in vitro and in organello
systems
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000906
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/54/
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000000906
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open access