dc.contributor.author
Chen, Tao
dc.date.accessioned
2018-06-07T21:42:06Z
dc.date.available
2016-07-20T12:05:24.768Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/8298
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-12497
dc.description.abstract
Higher eukaryotes take advantage of alternative splicing to gain and expand
the transcriptome complexity and proteome diversity without increasing the
number of genes. In comparison to other organisms, the humans utilize the most
complex alternative splicing events. With the increase of complexity along the
evolution, the susceptibility of splicing to mis-regulation also increases.
Although lots of mutations within splicing factors have been found to
associate with various human diseases so far, only very few have been
identified in the basal components of spliceosome as causing factors of human
diseases. Consequently, it leads to a severe shortage of established human
disease models to investigate the functions of these basal components. This
thesis aims to identify and functionally characterize a key de novo mutation
in a basal component of spliceosome putatively associated with a human
disease. In this study, a missense heterozygous mutation in the gene snrpE was
identified by the whole exome sequencing from a family with a child suffering
from non-syndromal microcephaly and intellectual disability. The snrpE gene
encodes the SmE protein, an indispensible spliceosomal component. The gene as
well, the mutated site is deeply conserved in different species. The available
3D structure data indicates that the point mutation might affect the assembly
of snRNPs, which could be supported by our biochemical and immunofluorecent
results showing the decreased integration capacity and aberrant cytoplasmic
enrichment of the mutant protein. To further investigate the functional
relevance of the identified mutation on splicing pattern at the whole
transcriptome level, the RNA-seq was applied and the results showed that the
mRNA splicing is abnormal in the patient derived fibroblasts and increased
intron retention is the major defect. Similar effect on mRNA splicing can be
recapitulated in SmE deficient HEK293 cells induced by siRNA knock down
approach, indicating the pivotal role of this mutation in the splicing
function of SmE. To clearly pinpoint the function of this mutation, we
combined the recently developed CRISPR/Cas9 and piggyBac transposon system to
introduce the mutation into the genomic loci in HEK293 cells. The RNA-seq data
showed again that the mutation can induce a similar splicing defect as
observed in the patient derived fibroblasts. Taken together, our results
showed that the de novo missense mutation we identified affects the functional
amount of snRNPs by interfering the early assembly phase, leading to the
transcriptome-wide mRNA aberrant splicing.
de
dc.description.abstract
Nahezu alle protein-codierenden Gene höherer Eukaryonten enthalten nicht-
codierende Sequenzabschnitte (Introns), welche die codierenden Abschnitte
(Exons) unterbrechen. Für die Ausbildung des offenen Leserahmens werden die
Introns durch einen komplexen Prozessierungsschritt, dem sog. Spleißen,
entfernt und die Introns präzise zur reifen mRNA vereinigt. Dieser Prozess
wird durch das Spleißosom katalysiert, einer makromolekularen Maschine
bestehend aus kleinen RNA-Proteinkomplexen (snRNPs) und einer großen Anzahl
von Proteinfaktoren. Speziell bei höheren Eukaryonten findet man neben dem
kanonischen Spleißen auch das sog. alternative Spleißen, d.h. die wahlweise
Inklusion bzw. Exclusion von Exons in einem Transkript. Dieser Prozess ist
hoch-reguliert und erlaubt die massive Ausweitung der Transkriptom- bzw.
Proteom diversität, ohne dabei die Anzahl ihrer Gene zu erhöhen. Genetische
Krankheiten des Menschen werden häufig durch Mutationen in den Spleißsignalen
auf der mRNA oder in Spleißfaktoren gefunden. Jedoch sind bislang nur sehr
wenige Fälle bekannt, bei denen Mutationen in den Hauptbestandteilen der
Spleißmaschinerie menschliche Krankheiten hervorrufen. Dies führt zu einem
Engpass an etablierten Modellkrankheiten, die zur Erforschung grundlegender
Faktoren und deren Funktionen dienen könnten. Ziel der Dissertation war die
Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einer de novo Mutation in
einem konstitutiven Bestandteil des Spleißosoms, welche vermeintlich in
Verbindung zu einer menschlichen Erkrankung steht. Hierbei handelt es sich um
eine Missense-Mutation im snrpE Gen. Diese wurde mittels Exomsequenzierung in
einer Familie identifiziert, deren Nachkommen Mirkozephalie und geistige
Retardation aufweist. Das snrpE Gen codiert für das evolutionär hoch-
konservierte SmE Protein, einem essentiellen Grundbaustein des Spleißosoms.
Kristallstrukturen des Proteins weisen darauf hin, dass die Punktmutation die
Inkorporation des Proteins in das Spleißosom beeinflussen könnte. Diese
Vermutung wurde durch biochemische und Zellbiologische Untersuchungen in
dieser Arbeit bestätigt. Zum einen zeigen Immunofluoreszenz Untersuchungen die
verminderte Integrationsfähigkeiten und anomale zytoplasmatische Anreicherung
des Mutierten SmE Proteins. Zum anderen zeigen biochemische Untersuchungen,
dass die Zusammenlagerung der snRNPs gestört ist. Da das SmE Protein ein
Grundbaustein des Spleißosoms ist, lag die Annahme nahe, dass die mRNA
Prozessierung ebenfalls betroffen ist. Um dies zu Untersuchen, wurden
Fibroblasten des Patienten hergenommen um deren RNA zu Sequenzieren. Hierbei
wurde deutlich, dass einbehaltende Introns den Haupteffekt darstellen und
somit das Spleißen gestört ist. Um die Effekte der Mutation
Patientenunabhängig betrachten zu können, wurden zusätzliche Experimente in
der Zellkultur an HEK293 Zellen durchgeführt. Hierfür wurden zum einen mittels
siRNA die Menge an SmE vermindert und zum anderen mit Hilfe der kürzlich
entwickelten CRISPR/Cas9 und piggyBAC Transposon Systeme die Mutation des
Proteins künstlich in die Zellen eingebracht. Sowohl die Verminderung von SmE
als auch die künstliche Mutation zeigten die gleichen Auffälligkeiten wie die
Spleißanomalien des Patienten. Zusammenfassend zeigten unsere Experimente,
dass die von uns identifizierte de novo Missense-Mutation, die Funktionalität
des Spleißosoms erheblich einschränkt. Ausgelöst wird dies durch ein
eingeschränktes Zusammenlagern der kleineren snRNP Proteinkomplexe. Diese
Einschränkung führt zu transkriptomweiten abnormen Spleißen.
de
dc.format.extent
VII, 96 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
basal component of spliceosomal UsnRNP
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Identification and functional characterization of a de novo point mutation
identified in a patient with non-syndromal microcephaly and intellectual
disability
dc.contributor.contact
tao.chen@mdc-berlin.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Constance Scharff
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wei Chen
dc.date.accepted
2016-07-14
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000102536-2
dc.title.translated
Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einer de-novo Punktmutation
eines Patienten mit nicht-syndromaler Mikrozephalie und eingeschränkter
Intelligenz
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000102536
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000019612
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free
dcterms.accessRights.openaire
open access